阿莫西林膠囊微生物檢查方法學研究

閔紅 楊曉莉 李翠 周志云

(陜西省食品藥品監督檢驗研究院，西安 710065)

微生物限度檢查法和控制菌檢查法是檢查非無菌滅菌制劑及其原料、輔料受微生物污染程度的重要方法[1]。藥品檢測質量的好壞直接影響到藥品使用的安全性。因此，必需確保藥品微生物檢查的質量和效率[2]。

阿莫西林屬于半合成類青霉素，對肺炎鏈球菌、溶血性鏈球菌等鏈球菌屬、不產青霉素酶葡萄球菌、糞腸球菌等需氧革蘭陽性菌；大腸埃希菌、奇異變形菌、沙門菌屬、流感嗜血菌、淋病奈瑟菌等需氧革蘭陰性菌，不產β-內酰胺酶菌及幽門螺桿菌具有良好的抗菌活性。阿莫西林通過抑制細菌細胞壁合成而發揮殺菌作用，可使細菌迅速成為球狀體而溶解、破裂[3]。

抗生素類藥物制劑均具有一定的抑菌性[4]。微生物受到抗生素抑菌性的影響不能生長繁殖，但這些微生物細胞并未死亡，僅僅受到損傷。當藥物制劑進入人體內，其抑菌成分在體內被稀釋，受損微生物逐漸復蘇并進行生長繁殖，從而對人類健康造成危害。如果不去除其抑菌性，直接采用常規法對藥物制劑進行檢查，就會出現“假陰性”檢查結果。微生物適用性研究的目的就是為了去除藥物制劑的抑菌性，為藥物制劑探尋有效和實用的檢查方法。

本文采用了平皿法、稀釋法、薄膜過濾法、中和法等14種方法對阿莫西林膠囊進行微生物限度方法適用性研究，比較了稀釋法、薄膜過濾法和中和法去除阿莫西林膠囊抑菌性的能力；考察了聚山梨酯80、卵磷脂和β-內酰胺酶作為中和劑去除其抑菌性的能力；并考察了將不同單位β-內酰胺酶添加于稀釋劑、沖洗液、培養基中去除抑菌性的能力。采用了直接接種法和中和法對阿莫西林膠囊進行大腸埃希菌方法適用性研究，建立了阿莫西林膠囊微生物限度與控制菌的檢查方法。

1 儀器與材料

1.1 儀器

生物安全柜(型號：HFsafe-1200 LC，上海力申科學儀器有限公司)；電子分析天平(型號：BS2202S，德國賽多利斯公司)；水浴恒溫振蕩器(型號：SHA-C，天津鑫博得有限公司)；生化培養箱(型號：LRH-250B，上海一恒科學儀器有限公司)；生化培養箱(型號：LRB-250B，上海一恒科學儀器有限公司)；全自動微生物鑒定系統(型號：VITEK2，法國Bio-Mérieux有限公司)；三目顯微鏡(型號：OLYMPUS.CH，日本奧林巴斯公司)。

1.2 供試品

阿莫西林膠囊，西安康拜爾制藥有限公司，批號：20160103。

1.3 菌種

金黃色葡萄球菌CMCC(B)26003、大腸埃希菌CMCC(B)44102、銅綠假單胞菌CMCC(B)10104、枯草芽孢桿菌C M C C(B)6 3 5 0 1、白念珠菌CMCC(F)98001和黑曲霉CMCC(F)98003。上述標準菌株均源于中國醫學細菌保藏管理中心，工作用菌株為第二代。

1.4 試劑

稀釋劑：胰酪大豆胨液體(TSB)；中和劑1：2%卵磷脂和2%吐溫80；中和劑2：β-內酰胺酶，2mL/支，446萬單位/mL，中國食品藥品檢定研究院生產；沖洗液：0.1%蛋白胨緩沖液。

培養基：胰酪大豆胨瓊脂(TSA)、沙氏葡萄糖瓊脂(SDA)、沙氏葡萄糖液體(SDB)、麥康凱液體、麥康凱瓊脂、溴化十六烷基三甲胺瓊脂、甘露醇氯化鈉瓊脂。以上試劑除β-內酰胺酶外，其他均由北京陸橋技術有限公司生產。

2 方法

2.1 菌液制備

將金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌分別接種于TSB中，35℃培養24h；將白念珠菌接種于SDB中，25℃培養3d。將黑曲霉接種于SDA上，25℃培養7d，加入5mL含0.05%(mL/mL)聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液，洗脫孢子，收集孢子懸液，用含0.05%(mL/mL)聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液制成適宜濃度的孢子懸液。采用10倍稀釋法將金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白念珠菌和黑曲霉分別稀釋到104CFU/mL，將大腸埃希菌稀釋至不大于100CFU/mL。

2.2 微生物限度方法適用性

2.2.1 平皿法(1:10供試液)

供試液制備：取阿莫西林膠囊10g，分別加TSB至100、200和500mL，45℃恒溫振搖15min使其溶解，分別制成1:10、1:20和1:50供試液。

試驗組制備：取制備好的1:10供試液分裝于5個無菌試管中，每管裝量為9.9mL，再分別加入含菌量不大于104CFU/mL的金黃色葡萄球菌(革蘭陽性菌代表)、銅綠假單胞菌(革蘭陰性菌代表)、枯草芽孢桿菌(芽孢菌群代表)、白念珠菌(酵母菌代表)、黑曲霉(霉菌代表)5種試驗菌液0.1mL[5]。

菌液對照組制備：將TSB分裝于5個無菌試管中，每管裝量為9.9mL，同試驗組操作分別加入含菌量不大于104CFU/mL的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白念珠菌、黑曲霉試驗菌液0.1mL。

供試品對照組制備：取制備好的1:10供試液9.9mL，加入TSB 0.1mL。

回收率計算[6]：分別取上述試驗組、菌液對照組和供試品對照組1mL，置于直徑90mm培養皿中，注入TSA或SDA，混勻，凝固，TSA平板在35℃培養3d，SDA平板在25℃培養5d，計數。供試品5種試驗菌的回收率均需進行3次重復試驗，若供試品5種試驗菌的回收率均在0.5～2范圍內，供試品的需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數計數的方法適用性試驗通過。供試品回收率=(試驗組菌落數-供試品對照組菌落數)/菌液對照組菌落數×100%。

2.2.2 稀釋法(1:20供試液)

稀釋法1：將1:20供試液替代1:10供試液，其余操作同平皿法。

稀釋法2(1:50供試液)：將1:50供試液替代1:10供試液，其余操作同平皿法。

稀釋法4(1:50供試液結合150mm培養皿)：將1:50供試液替代1:10供試液，150mm替代90mm培養皿，其余操作同平皿法。

2.2.3 薄膜過濾法

供試液、試驗組、菌液對照組和供試品對照組制備過程同平皿法，分別取上述制備好的試驗組、菌液對照組和供試品對照組1mL加入含50mL 0.1%蛋白胨溶液的薄膜過濾器中，過濾，再用0.1%蛋白胨溶液沖洗5次，100mL/次，將濾膜正面朝上貼于TSA上培養、計數。

2.2.4 薄膜過濾結合中和法

薄膜過濾結合中和法1(將中和劑1添加于稀釋劑)：在供試液制備過程，用含2%卵磷脂和2%吐溫80的TSB取代TSB作為稀釋劑。其余操作同薄膜過濾法。

薄膜過濾結合中和法2(將中和劑1添加于沖洗液)：在沖洗過程，用含2%卵磷脂和2%吐溫80的0.1%蛋白胨溶液取代0.1%蛋白胨溶液作為沖洗液，其余操作同薄膜過濾法。

薄膜過濾結合中和法3(將中和劑1添加于培養基)：將含2%卵磷脂和2%吐溫80的TSA取代TSA作為培養基，其余操作同薄膜過濾法。

2.2.5 中和法

中和法1(含2mL中和劑2的1:20供試液)：供試液制備：取阿莫西林膠囊10g，加入含446萬單位β-內酰胺酶的TSB至200mL，45℃恒溫振搖15min使其溶解，制成1:20供試液。其余操作同平皿法。

中和法2(含2mL中和劑2的1:50供試液)：供試液制備：取阿莫西林膠囊10g，加入含446萬單位β-內酰胺酶的TSB至500mL，45℃恒溫振搖15min使其溶解，制成1:50供試液。其余操作同平皿法。

中和法3(將2mL中和劑2添加于1:50供試液結合150mm培養皿)：供試液制備：取阿莫西林膠囊10g，加入含446萬單位β-內酰胺酶的TSB至500mL，45℃恒溫振搖15min使其溶解，制成1:50供試液，并用150mm培養皿替代90mm培養皿，其余操作同平皿法。

中和法4(含5mL中和劑2的1:50供試液)：供試液制備：取阿莫西林膠囊10g，加入含1115萬單位β-內酰胺酶的TSB至500mL，45℃恒溫振搖15min使其溶解，制成1:50供試液。其余操作同平皿法。

中和法5(含5mL中和劑2的TSA培養基)：采用100mL含1115萬單位β-內酰胺酶的TSA替代TSA，其余操作同平皿法。

中和法6(將5mL中和劑2添加于稀釋劑和培養基)：供試液制備：取阿莫西林膠囊10g，加入含446萬單位β-內酰胺酶的TSB至500mL，45℃恒溫振搖15min使其溶解，制成1:50供試液，并用100mL含1115萬單位β-內酰胺酶的TSA替代TSA，其余操作同平皿法。

2.3 控制菌檢查方法適用性研究

2.3.1 直接接種法

供試品制備同平皿法。

大腸埃希菌：取1:10供試液10mL分別接種至100、300和500mL胰酪大豆胨液體培養基中，同時接入含菌量不大于100CFU的大腸埃希菌，混勻，35℃培養18h。取上述培養物1mL接種至100mL麥康凱液體培養基，42℃培養24h。取麥康凱液體培養物劃線接種于麥康凱瓊脂平板上，35℃培養18h。同步進行陽性、陰性對照試驗。用VITEK2全自動微生物鑒定系統對典型菌落進行鑒定，若檢出大腸埃希菌，則供試品的大腸埃希菌檢查方法適用性試驗通過。

2.3.2 中和法

供試品制備同平皿法。

大腸埃希菌：取1:10供試液10mL分別接種至含223、446和892萬單位的β-內酰胺酶的TSB 100mL，其余操作同直接接種法。

3 結果

3.1 微生物限度方法適用性研究

3.1.1 采用平皿法進行需氧菌總數方法適用性研究

阿莫西林膠囊采用平皿法(1:10供試液)進行需氧菌總數(表1)、霉菌和酵母菌總數(表2)方法適用性研究，發現白念珠菌和黑曲霉的回收率均在0.5～2范圍內，符合藥典要求。結論：可采用平皿法(1:10供試液)對阿莫西林膠囊進行霉菌和酵母菌總數檢查。

當增大稀釋劑TSB的體積，采用1:20供試液時(稀釋法1)，銅綠假單胞菌的回收率均大于0.7，但是金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的回收率仍為0；而采用1:50供試液，甚至結合采用150mm較大培養皿的方式(稀釋法2和3)，金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的回收率始終為0。因此，不可采用平皿法和稀釋法對阿莫西林膠囊進行需氧菌總數檢查。結果揭示了阿莫西林膠囊對革蘭陽性菌和芽孢桿菌類具有較強抑制作用，對革蘭陰性菌具有較弱的抑菌作用，對霉菌和酵母菌無抑菌作用。

表1 采用平皿和稀釋法進行需氧菌總數方法學研究的回收率Tab. 1 Recovery rate of total amount of aerobe methodology by plate and dilution methods

表2 采用平皿法進行霉菌和酵母菌總數方法學研究回收率Tab. 2 Recovery rate of total amount of molds and yeast methodology by plate methods

3.1.2 采用薄膜過濾結合中和法進行需氧菌總數方法適用性研究

阿莫西林膠囊采用薄膜過濾法(沖洗500mL/膜)進行需氧菌總數(表3)方法學研究，發現金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的回收率仍為0。聚山梨酯80是一種非離子型表面活性劑，在藥劑中起到增溶和乳化的作用[7-8]，聚山梨酯80和卵磷脂聯用能有效去除藥物制劑的抑菌活性，對微生物生長無毒副作用[9-10]。聚山梨酯80和卵磷脂是中國藥典中涉及的藥品微生物方法學研究中常用中和劑。本研究分別在稀釋劑TSB、培養基TSA、稀釋劑結合培養基分別添加了2%的卵磷脂和2%的聚山梨酯80(中和劑1)，發現將中和劑1添加于稀釋劑TSB中(薄膜過濾結合中和法1)，金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的回收率仍為0，表明采用薄膜過濾法無法去除該供試品的抑菌性，將卵磷脂和聚山梨酯80加入稀釋劑TSB也無法消除該供試品的抑菌活性；將中和劑1添加于培養基TSA(薄膜過濾結合中和法2)、稀釋劑TSB和培養基TSA中(薄膜過濾結合中和法3)，試驗組和供試品對照組菌落均成片生長，無法計數。將成片生長的“菌落”接種于TSA平板，發現無菌落生長，證明了該成片生長的白色物質并非細菌。卵磷脂在培養基TSA中的不充分溶解是造成培養基上有類似菌落物質出現的原因。因此，不可采用薄膜過濾法、薄膜過濾結合中和法(2%的卵磷脂和2%的聚山梨酯80)對阿莫西林膠囊進行需氧菌總數檢查。

3.1.3 采用中和法(β-內酰胺酶)進行需氧菌總數方法適用性研究

阿莫西林膠囊采用中和法進行需氧菌總數(表4)方法適用性研究，將446萬單位β-內酰胺酶添加到1:20(中和法1)、1:50供試液(中和法2)及1:50供試液結合150mm培養皿(中和法3)，金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌回收率均未達到藥典要求的0.5～2.0范圍內，并且中和法1、2和3的回收率并無顯著性差異。將1115萬單位的β-內酰胺酶添加于1:50供試液中(中和法4)，其回收率顯著性提高，金黃色葡萄球菌平均回收率為1.2，枯草芽孢桿菌為0.9，符合藥典要求。表明對于阿莫西林膠囊，添加β-內酰胺酶的劑量恒定，增加稀釋劑的體積不能有效提高試驗菌的回收率；而稀釋劑的體積恒定，增加β-內酰胺酶的劑量能有效提高試驗菌的回收率。

將β-內酰胺酶添加于培養基TSA中(中和法5)，回收率均為0，分析原因可能由于β-內酰胺酶在TSA中與供試品作用的時間較短，沒有與抑菌性物質充分反應，固體培養基就冷卻凝固，因此不能有效去除供試品的抑菌性；將稀釋劑和培養基中同時添加β-內酰胺酶(中和法6)與僅僅在稀釋劑中添加β-內酰胺酶(中和法4)的回收率均符合藥典要求，但無顯著性差異，近一步證明將β-內酰胺酶添加到培養基的作用微乎其微。因此，可采用在稀釋劑TSB中加1115萬單位β-內酰胺酶的方法對阿莫西林膠囊進行需氧菌總數檢查。

表3 采用薄膜過濾結合中和法進行需氧菌總數方法學適用性研究的回收率Tab. 3 Recovery rate of total amount of aerobe methodology by membrane filtration and neutralization methods

表4 采用中和法進行需氧菌總數方法學研究回收率Tab. 4 Recovery rate of total amount of aerobe methodology by neutralization methods

3.2 控制菌檢查方法適用性研究

3.2.1 采用直接接種法進行大腸埃希菌檢查方法適用性研究

阿莫西林膠囊采用直接接種法(TSB分別為100、200和500mL)進行大腸埃希菌方法學適用性研究(表5)，試驗組均未檢出大腸埃希菌。因此，不可取1:10供試液10mL直接接種至胰酪大豆胨液體培養基100、200和500mL，進行該供試品的大腸埃希菌檢查。

3.2.2 采用中和法進行大腸埃希菌檢查方法適用性研究

阿莫西林膠囊采用中和法(中和劑分別為223、446、892萬單位的β-內酰胺酶)進行大腸埃希菌方法學適用性研究(表6)，試驗組均檢出大腸埃希菌。因此，可取1:10供試液10mL接種至分別含223、446、892萬單位β-內酰胺酶的胰酪大豆胨液體培養基100mL，進行該供試品的大腸埃希菌檢查。研究結果表明，阿莫西林膠囊對大腸埃希菌具有一定的抑制作用，針對β-內酰胺類抗生素通過增加稀釋劑TSB的體積不能有效去除該供試品的抑菌性，僅通過在稀釋劑中添加適量β-內酰胺酶才能有效去除抑菌成分。

4 討論

微生物計數法系用于能在有氧條件下對供試品生長的嗜溫細菌和真菌計數[6]。當供試品有抑菌活性時，可以采用下列方法減弱或消除供試液的抑菌活性，再依據確認的方法對該產品進行檢驗。

(1)增加稀釋劑或培養基體積[6]。取規定量供試液，至較大體積稀釋劑或培養基中，通過對抑菌成分的稀釋，減弱或消除供試液的抑菌活性[6]。研究結果表明：對于β-內酰胺類抗生素，增大稀釋劑和培養基的體積不能有效去除其抑菌性。

表5 采用直接接種法進行大腸埃希菌方法學適用性試驗結果Tab. 5 Results of microbe-controlling methodology test by direct inoculation methods

表6 采用中和法進行大腸埃希菌檢查方法適用性試驗結果Tab. 6 Results of microbe-controlling methodology test by neutralization methods

(2)采用薄膜過濾法[6]。通過薄膜過濾法可將供試品中抑菌物質的過濾掉，達到減弱和消除抑菌活性的作用。一般對于抑菌性弱的藥物制劑，建議采用稀釋法，對于抑菌性強的藥物制劑，采用薄膜過濾法[11]。本研究中阿莫西林膠囊對金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌具有較強的抑菌作用，而采用薄膜過濾法不能有效去除其抑菌性，試驗菌的回收率仍為0。

(3)加入適宜的中和劑或滅活劑。中和劑或滅活劑可用于消除干擾物的抑菌活性[12]，可將其添加到稀釋劑、沖洗液或培養基中鈍化、中和其抑菌活性。該研究在阿莫西林膠囊的稀釋劑中添加了2%的卵磷脂和2%的聚山梨酯80，金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的回收率為0，在沖洗液和培養基中添加后無法計數，充分證明β-內酰胺類抗生素不能采用聚山梨酯80和卵磷脂作為中和劑進行需氧菌總數的檢查。

β-內酰胺酶是耐藥菌產生的具有水解青霉素、頭孢菌素等β-內酰胺類抗生素活性的酶[13]。本研究考察了β-內酰胺酶添加于稀釋劑、培養基、稀釋劑與培養基同時添加3種方式對阿莫西林膠囊抑菌性的去除效果，發現在稀釋劑中添加446萬單位的β-內酰胺酶不能有效去除其抑菌性，添加1115萬單位可有效去除其抑菌性，而將1115萬單位β-內酰胺酶添加于培養基中，由于作用時間較短而不能達到相應的效果。

總而言之，對于β-內酰胺類抗生素，采用稀釋法、薄膜過濾法均無法有效去除其抑菌性，應首選中和法；中和劑聚山梨酯80和卵磷脂的添加也不能有效去除其抑菌性，中和劑應首選β-內酰胺酶；將β-內酰胺酶添加于培養基中也無法去除其抑菌性，應首選添加于稀釋劑；在稀釋劑中添加446萬單位的β-內酰胺酶不能有效去除其抑菌性，添加1115萬單位可有效去除其抑菌性。

微生物方法學研究的目的，首先為藥物制劑尋求一個可行性好的微生物檢查方法，更重要是該方法操作簡單、成本低廉、污染風險低，可滿足企業微生物檢驗的常態化和規范化?？股仡愃幬镏苿┑囊志苑浅?，稀釋法一般無法去除其抑菌性，薄膜過濾法操作復雜，成本較高，那么，為抗生素類藥物制劑探尋適宜的中和劑成為其微生物檢驗的一個方向和難點。下一步計劃對不同類型抗生素篩選出適宜的中和劑，并優化其加入量、加入方式等因素，提高檢驗檢測技術水平，確保人民群眾的用藥安全。