一種商用乳品發酵劑中微生物的組成分析

徐偉良，郭梁,3，李春冬，郭元晟,3，郝苗苗，王亞慧，王東玉，朱建軍，錢俊平,3，雅梅,3

（1.錫林郭勒職業學院，內蒙古錫林浩特026000；2.錫林郭勒生物工程研究院，內蒙古錫林浩特026000；3.錫林郭勒食品檢驗檢測和風險評估中心，內蒙古錫林浩特026000）

0引 言

乳品發酵劑通常指用于酸奶、奶酒、奶豆腐、奶酪、奶油等發酵產品生產的細菌以及其他微生物的培養物。市場上常見發酵劑大多由益生菌組成，例如，酸奶發酵劑一般由嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌兩種乳酸菌組成[1]；馬奶酒發酵劑由酵母菌聯合嗜酸乳桿菌及瑞士乳桿菌組成[2]；蒙古族奶豆腐發酵劑由乳酸鏈球菌和乳油鏈球菌組成[3]。益生菌（Probiotics）是一類能夠促進宿主腸內微生物菌群的生態平衡，對宿主健康或生理功能產生有益作用的活性微生物[4]。迄今為止，科學家已發現的益生菌大體上可分成三大類，其中包括乳桿菌屬（如干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌、詹氏乳桿菌等）；雙歧桿菌屬（如長雙歧桿菌、短雙歧桿菌、嗜熱雙歧桿菌、卵形雙歧桿菌等）和革蘭氏陽性球菌屬（如乳球菌、糞鏈球菌、中介鏈球菌等）[5-7]。此外，明串球菌屬、丙酸桿菌屬和芽孢桿菌屬的部分菌種株，以及一些霉菌與酵母菌等亦可歸入益生菌的范疇[8]。

利用分子生物學方法對微生物多樣性的鑒定可分為非培養模式與培養模式兩種[9]。非培養模式采用直接從樣品中提取微生物的核酸，通過菌群的核酸進行序列分析。這種非培養模式的分子生物學方法避開了微生物分離培養的過程，能夠更加深入快捷的了解微生物的多樣性[10]。然而這種方法也存在一定的弊端，引物與模版的匹配性、樣品中微生物含量過少、一些核酸片段的共泳效應等問題的存在，都可能導致核酸的不可檢測。培養模式一般是通過傳統的微生物分離方法進行大量的平板分離，選擇合適的培養基對分離的微生物進行培養。通常選擇乳酸細菌培養基（MRS）對乳酸菌進行培養，馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）對酵母菌等真菌進行培養[11]。根據菌落的形態和顏色進行隨即挑選，進一步使用隨機擴增多態性PCR（Random Amplified Polymorphic DNA-PCR，RAPD-PCR）、限制性內切酶片段長度多態性（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）、基因外重復回文系列PCR（Repetitive Extragenic Palindromic，Rep-PCR）、脈沖場凝膠電泳 (Pulsed Field Gel Electrophoresis，PFGE)等方法對微生物的親緣關系及多樣性進行分析[12-13]。然而在菌落挑選階段，由于大量的菌落基本相似，難以憑肉眼區分，這在一定程度上影響了多樣性研究的準確性。因此，將非培養模式與培養模式兩種方法結合使用，對微生物多樣性的鑒定分析，才能更加準確有效。

蒙古族乳制品歷史悠久，作法考究，風味獨特，是蒙古族人民的必需食物之一[14]。錫林郭勒盟地區作為內蒙古的產乳大盟，也是三大綠色黃金乳源基地之一，具有豐富的傳統乳制品資源，包括奶豆腐、酸奶、奶酒、奶皮子、奶酪、稀奶油及黃油等[15]。遺憾的是，這些乳制品的生產仍處于傳統的手工作坊階段，大多數產品采用自然發酵，導致質量差異很大，且不穩定。以傳統奶豆腐為例，其在發酵過程中采取的即為自然發酵,利用自身和環境中的微生物進行發酵,但由于在整個發酵過程中微生物環境比較復雜且存在不確定性,生產出的奶豆腐的感官、品質都不穩定，不能大規模、工業化生產[16]。因此，為了更好地開發蒙古傳統乳制品，研發適合乳制品發酵的發酵劑，提高了產品的品質和穩定性，使傳統蒙古族乳制品形成規?；?、產業化，是具有非常重要的意義。

1 器材與試劑

1.1 材料

商用發酵劑（購于商業公司，微生物成分保密）。

1.2 試劑

Takara快速提取試劑盒（Code No.9164）；100 bp DNA Ladder（Lot#L20208）；EasyTaq?PCR Super Mix（Lot#K20614）；Takara Mini BEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0（Code No.9762）；MRS培養基：蛋白胨10 g、牛肉粉7.5 g、酵母浸粉5 g、磷酸氫二鉀2 g、檸檬酸二銨 2 g、乙酸鈉 5 g、葡萄糖 20 g、吐溫-80 1 mL、硫酸鎂0.58 g、硫酸錳0.25 g、瓊脂15 g、蒸餾水 1 L，pH 7.0，121℃滅菌20 min；PDA培養基：馬鈴薯切片200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、蒸餾水 1 L，pH 7.0，121℃滅菌20 min。

1.3 儀器

FA2004N電子天平、SW-J-2FD凈化工作臺、HWS-250BX恒溫恒濕培養箱、厭氧袋（含產氣包、厭氧指示劑）、2720 Thermal Cycler PCR擴增儀、MLS-3751L-PC高溫高壓滅菌鍋、5418R臺式高速離心機、WD-9413B凝膠成像儀、瓊脂糖凝膠電泳系統。

2 實驗方法

2.1 乳品發酵劑供試樣品的分子鑒定

2.1.1 DNA提取

發酵劑的基因組總DNA采用Takara快速提取試劑盒對其進行提取。取50μL Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR于滅菌的EP管中。用滅菌槍頭挑取單菌落，置于EP管中攪拌幾下。80℃熱變性15 min，低速離心（8000 rpm，5 min），將上清液取出放入新的EP管中，作為PCR反應的模板。

2.1.2 PCR擴增

選用真菌通用引物ITS1/ITS4與ITS4/ITS5擴增5.8S rDNA基因片段。引物序列分別為：ITS1（5'-TCCG TAGGTGAACCTGCGG-3'），ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'），ITS5（5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'）。細菌選用16S rDNA V3片段的 2對通用引物（27F/1495R）用于擴增。引物序列分別為：27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')，1495R(5'-CTACGGCTACCT-TGTTACGA-3')。擴增結果用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2.1.2.1 PCR反應體系

40μL反應體系：模板DNA 2μL、引物各2μL、dd H2O 14μL、EasyTaq PCR Super Mix 20μL。

2.1.2.2細菌PCR反應條件

94℃預變性5 min；94℃變性 1 min、58℃退火1 min、72℃延伸2 min，共30循環；72℃末端延伸10 min；

2.1.2.3 真菌PCR反應條件（Touchdown）

第一階段，95℃預變性 3 min；95℃變性30 s、69℃退火30 s、每循環降低退火溫度1℃、72℃延伸1 min，共15循環。第二階段，95℃變性30 s、47℃退火30 s、72℃，延伸 1 min，共20循環；73℃加強延伸1 min。

2.1.3 序列測定

將PCR擴增產物利用Takara MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0進行回收。具體步驟如下：在紫外燈下切出含有目的DNA的瓊脂糖凝膠放置于EP管中，向膠塊中加入溶解液Buffer GM，振蕩混合，放入50℃金屬浴中溶解膠塊。將溶解的膠塊溶液轉移至Spin Column，12 000 rpm離心1 min，棄濾液。再將700μL的Buffer WB加入 Spin Column中，室溫12 000 rpm離心1 min，重復上述操作一次。將Spin Column安置于新的EP管上，在Spin Column膜的中央處加入30μL滅菌蒸餾水靜置1 min后室溫12 000 rpm離心1 min洗脫DNA。將回收的DNA擴增產物送北京睿博生物科技有限公司，用相同引物進行測序。測序結果經拼接后在NCBI數據庫中進行BLAST同源比對。

2.2 發酵劑樣品中益生菌的分離培養

取一定量無菌處理好的樣品轉移至50 mL含0.85%生理鹽水的三角瓶內，將三角瓶在漩渦振蕩器上振蕩3 min。震蕩后用接種環取稀釋后的菌液，分別在PDA、MRS兩種平板培養基上進行劃線，將MRS平板倒置于37℃恒溫培養箱中，厭氧培養3 d；PDA平板倒置于30℃恒溫培養箱中，培養5 d，觀察菌落生長狀況。

2.3 分離菌種的分子鑒定

通過菌落觀察PDA平板培養基中未有微生物菌落生長，因此，只在分離培養的6個平行皿的MRS平板培養基中，分別隨機挑取3個單菌落進行基因組總DNA的提取。同樣采用Takara快速提取試劑盒對菌落總DNA進行提取，PCR擴增同“2.1.2.2”PCR反應條件。

3 結果與討論

3.1 發酵劑DNA測定結果

將乳品發酵劑以細菌27F/1495R為引物，設置3個平行，進行PCR反應，并將擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳（如圖1A）。由圖1A可知，D1、D2、D3的三個重復電泳條帶在1 500 bp處清晰且唯一，沒有其他雜帶，說明該條帶是經過PCR擴增反應得到的特異性帶，符合27F/1495R為引物的目的條帶大小。將乳品發酵劑分別以真菌ITS1/ITS4和ITS4/ITS5為引物，并設置3個平行，進行PCR反應，并將擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳（如圖1B）。由圖1B可知，分別以ITS1/ITS4和 ITS4/ITS5為引物的3個平行樣（D1～D3與d1～d3），均未出現目的條帶，可推測發酵劑中不含酵母菌等真菌菌群。并由圖1C發酵劑供試樣基因測序結果可知，基因測序序列有雜峰，在排除樣品干擾的情況下，推測可能存在多類乳酸菌，因此，將發酵劑進行菌種分離培養，進一步對其進行菌種鑒定。

圖1 發酵劑PCR擴增產物電泳圖與序列測定結果

3.2 發酵劑菌種分離培養結果

將乳品發酵劑通過微生物培養方法，分別接到MRS和PDA平板培養基進行培養，培養結果如圖2。由圖2可知，發酵劑在PDA平板培養基中未有微生物菌落生長，與圖1B電泳結果一致，因此可以確定，發酵劑中不含酵母菌等真菌菌群。由MRS培養基上劃線培養結果可知，MRS有乳酸菌菌落生長，且通過觀察，發現存在不同形態特征的單菌落，因此可以推斷發酵劑中不僅存在一種發酵劑菌群，還需進一步對菌株進行基因鑒定。

圖2 發酵劑菌種分離培養結果

3.3 發酵劑菌種序列鑒定結果

隨機挑取MRS培養基上18個單菌株（C1-C18）進PCR擴增，并經瓊脂糖凝膠電泳驗證后，送測序公司進行序列測序。經NCBI數據庫中進行BLAST同源比對表明，18個單菌株ident均為100%，其中13株為植物乳桿菌（Lactobacillusplantarum）；5株為干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）。

圖3 發酵劑菌種PCR擴增產物電泳圖與序列測定結果

4 結論與討論

通過基因鑒定（16SrDNA和ITS）與分離培養兩種方式對發酵劑中微生物組成進行分析，最終確定該種商用發酵劑是由植物乳桿菌（L.plantarum）和干酪乳桿菌（L.casei）組成。植物乳桿菌（L.plantarum）是乳酸菌的一種，廣泛存在自然發酵乳制品中，是許多發酵食品揮發性風味形成的重要菌株。植物乳桿菌能夠產生有機酸、細菌素、雙乙酰等多種天然活性成分，具有維持腸道內菌群平衡，提高機體免疫力，促進營養物質吸收等多種保健作用[17-18]。干酪乳桿菌（L.casei）屬于乳桿菌屬（Lactobacillus）的乳酸菌，與常用的嗜酸乳桿菌和雙歧桿菌兩大益生菌，一起被稱為“健康三益菌”。干酪乳桿菌能夠水解蛋白質，具有非常顯著的產酸和產香能力，常作為增香的輔助發酵劑應用在發酵制品生產中[19-20]。通過對以上對兩種乳桿菌的研究，可以認定該種商用乳品發酵劑能夠增加發酵乳制品的風味，提高其品質，在發酵乳制品的生產加工中具有重要的作用。目前，隨著我國人均生活消費水平的不斷提高，消費者對具有營養保健功能的益生菌發酵乳制品的需求越來越大，使得益生菌發酵劑具有極為廣闊的市場應用前景。然而，現有商業發酵劑的種類較少、微生物多樣性較低、供需的巨大差異等局限性，從而鼓勵研究人員從自然發酵食品中分離、鑒定以及開發益生菌資源。本研究中的微生物培養、分離及鑒定為錫林郭勒草原自然發酵乳制品中的益生菌資源開發提供了有益借鑒。