蘋果醋冷凍濃縮過程有機酸含量變化及抗氧化能力研究

門戈陽，李湘勤，鐘平娟，鐘瑞敏，*，單斌，謝思蕓，丘平

（1.韶關學院英東食品科學與工程學院，廣東 韶關 512005；2.韶關學院 物理與機電工程學院，廣東 韶關 512005；3.南昌大學 食品學院，江西 南昌 330047）

蘋果醋（apple cider vinegar）是以蘋果為主要原料，經酒精發酵、醋酸發酵制成的具有獨特酯香和果香的一種酸味產品，其酸味質量體現在有機酸的含量和組成上，其中有機酸除主要的乙酸外，還含有蘋果酸、乳酸、檸檬酸、琥珀酸等不揮發酸，這些有機酸決定了蘋果醋的酸味質量，尤其是蘋果酸和琥珀酸具有緩沖乙酸的刺激性，提高酸味平和性，使果醋酸味柔和、口感醇厚的作用，在很大程度上改善了果醋的不良刺激口感，同時賦予了果醋特征性的酸味，這對于風味較淡的蘋果醋產品質量來說極為重要。發酵型蘋果醋由于發酵條件較溫和，能夠有效保留蘋果中的營養成分，同時發酵過程中也產生了多種天然抗氧化劑等活性物質如酚類、黃酮類、維生素C、氨基酸等物質，可提高人體免疫力和具有保健等功能[1-2]。將發酵蘋果醋與冷凍濃縮技術相結合在國內外都鮮有研究，雖然國內冷凍濃縮起步較晚，但近10年來也開展了冷凍濃縮技術裝備在果汁、果酒等領域的應用研究[3-7]。采用分光光度法在517 nm 波長處可以檢測蘋果醋對DPPH 自由基的清除效果，評價其抗氧化能力。其能力用清除率來表示，清除率越大，其抗氧化能力越強[8]。

為了進一步評價蘋果醋的冷凍濃縮效果，本試驗中采用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）和分光光度法分別對蘋果原醋及冷凍濃縮過成中有機酸的含量和抗氧化能力進行分析測定，以闡明蘋果原醋中的主要有機酸含量及其抗氧化能力在濃縮過程中的變化，為蘋果醋冷凍濃縮技術的評價及改進提供理論依據和研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蘋果原醋（濃度5 %）：企業提供；蘋果醋冷凍濃縮過程樣液：試驗過程中得到，蘋果醋一級濃縮過程液：濃度5 %～12.5 %；蘋果醋二級濃縮過程液：濃度12.5%～25.0%；蘋果醋二級夾帶：濃度6.7%；蘋果醋一級夾帶/夾帶回收初始液：濃度1.9%；蘋果醋夾帶回收液：6.9%；終極夾帶：0.1%。

DL-蘋果酸（99%）、檸檬酸（98%）、琥珀酸（99%）乙酸（99.8%）（HPLC 純）：北京百靈威科技有限公司；D-乳酸（98%）（HPLC 純）：西亞試劑；磷酸氫二銨（分析純）：西隴化工股份有限公司；磷酸（分析純）：天津市廣成化學試劑有限公司；二苯基苦味肼基自由基（分析純）：東京化成工業株式會社；乙醇（分析純）：天津市富宇精細化工有限公司；甲醇（HPLC 純）：天津市科密歐化學試劑有限公司

1.2 儀器與設備

多功能冷凍濃縮機組：韶關學院廣東高?；洷碧厣称饭こ碳夹g開發中心自行設計；pH 計（FE20）：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；分析天平（BS124S）：賽多利斯（北京）公司；臺式高速離心機（TGL20M-Ⅱ）：鹽城市凱特實驗儀器有限公司；高效液相色譜儀（LC-15C）：日本島津公司；分光光度計（76 新世紀）：北京普析通用儀器有限責任公司；超純水過濾裝置（022246）：RES.JSCIENTIFIC INSTRUMENTSCO.LTD。

1.3 方法

1.3.1 冷凍濃縮樣品處理

將濃度為5%蘋果原醋采用韶關學院廣東高?；洷碧厣称饭こ碳夹g開發中心自行設計的漸進式冷凍濃縮機組進行兩級濃縮，得到一級濃縮液（12.5%）、二級濃縮液（25%）及相應夾帶液（冷凍濃縮結束放出濃縮液剩下的夾帶冰環溶解后的液體），每隔2 h 取樣進行濃度測定和有機酸含量的測定。濃縮復原液及相應夾帶進行抗氧化能力測定。F1 表示一級濃縮，F2 表示二級濃縮。

1.3.2 蘋果醋有機酸含量測定

1.3.2.1 樣品處理

將蘋果醋一級濃縮、二級濃縮過程樣液及夾帶回收液（高于原醋濃度），用蒸餾水稀釋復原至原醋濃度（5.0%），然后同原醋一起稀釋至濃度為1.0%，低于原醋濃度的一、二級夾帶液稀釋至1.0 %，終極夾帶（0.1 %）不作稀釋處理，所有樣品均用0.45 μm 針式有機相濾頭過濾于1.5 mL 進樣瓶中。

1.3.2.2 標品處理

精密稱取蘋果酸0.500 0 g、乳酸0.200 0 g、乙酸10.000 0 g、檸檬酸 0.150 0 g、琥珀酸 0.150 0 g，用超純水溶解定容至100 mL。蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸的質量濃度分別為 5.0、2.0、100、1.5、1.5 mg/mL，此為混合有機酸標準使用液。取適宜濃度標準使用液，用超純水定容至10 mL，混勻，得到系列混合標準溶液。將系列混合標準溶液經0.45 μm 微孔濾膜過濾后進樣，以峰面積（X）對有機酸含量（Y）求標準曲線回歸方程及相關系數。

1.3.2.3 色譜條件

1）檢測波長的確定：由于210 nm 紫外光對檸檬酸、蘋果酸、乙酸、乳酸和琥珀酸標準溶液有較強的吸收，并且光譜重復性好，最終確定檢測波長為210 nm。

2）流動相的選擇：為避免干擾有機酸的檢測，選擇在紫外區幾乎無吸收的磷酸鹽緩沖溶液作為流動相。常用的流動相體系有磷酸鹽緩沖液-甲醇、磷酸鹽緩沖液-乙腈、磷酸鹽緩沖液-甲醇-乙腈系列，因有機酸極性較大，流動相中水含量很高，會使酸產生電離，為了使有機酸盡可能以分子形式存在，一般使用磷酸調節pH 值使之成為酸性流動相來抑制有機酸的解離。本試驗選取流動相磷酸氫二銨的濃度分別為0、0.01、0.02 mol/L，流動相 pH 值 為 2.5、2.7、2.8、3.0，流動相配比為95%，98%和100%，流速為 0.5、0.8、1 mL/min，在20、30、40℃柱溫條件下時的分離效果，試驗結果表明，在流動相中沒有磷酸鹽緩沖液時，有機酸的分離效果很不好，在流動相中加入適量的甲醇，可以使各組分的保留時間縮短，并且抑制拖尾現象，改善峰形。當pH 值太低時，對色譜柱損害很大，隨著磷酸鹽濃度的增加，各種有機酸能夠得到分離，但是pH 值太高時，分離效果并不好，并且磷酸鹽的濃度過高，容易結晶造成色譜柱堵塞損壞色譜柱。當流動相流速太高時，柱壓升高，分離度降低，對色譜柱損害較大；流速太低，柱壓低，峰較寬，分離時間長。而柱溫升高會加快傳質過程，縮小分離度[9-12]。因此，綜合考慮流動相條件選擇如下：

Eclipse XDB-C18 柱（4.6 mm×250 mm）5 μm，流動相：2%甲醇-98%0.01 mol/L 磷酸氫二銨-磷酸緩沖液，pH 值為2.8；檢測器：紫外檢測器；檢測波長：210 nm；柱溫：30℃；流速：1.00 mL/min；進樣量：10 μL。兩次平行。

1.3.3 DPPH 自由基清除試驗[13-14]

1）DPPH 母液：準確稱取 DPPH 0.046 8 g，用無水乙醇定容于500 mL 容量瓶內，充分搖勻，4℃冰箱避光保存，備用。

2）樣品測定：取上述母液稀釋一倍為反應液，分別移取蘋果醋原液、一級濃縮液、二級濃縮液、二級夾帶液、一級夾帶液、夾帶回收初始液、夾帶回收液、終極夾帶液各1 mL，加入DPPH 反應液5 mL，充分搖勻，黑暗處靜止30 min 后，3 000 r/min 離心，取上清液，于517 nm處測吸光值，平行測定3 次，取平均值，按如下公式計算其DPPH 自由基清除率（E）：

式中：Ai為醋液加DPPH 溶液的吸光度；Aj為蒸餾水加DPPH 溶液的吸光度；A0為醋液加乙醇溶液的吸光度。

2 結果與分析

2.1 蘋果醋冷凍濃縮原醋及過程樣有機酸結果分析

通過高效液相色譜法測得各有機酸保留時間見圖1。

圖1 有機酸混合標準溶液高效液相色譜圖Fig.1 The high performance liquid chromatogram of the organic acids mixture standard solution

由圖1可得D-蘋果酸保留時間為3.533 min，乳酸保留時間為4.141 min，乙酸保留時間為4.407 min，L-蘋果酸保留時間為4.977 min，琥珀酸保留時間為5.391 min，檸檬酸保留時間為6.146 min。高效液相色譜法測得原醋及各級濃縮蘋果醋液、夾帶液中D-蘋果酸，乳酸，乙酸，L-蘋果醋，琥珀酸和檸檬酸的含量見圖2。

經測定知蘋果原醋中檸檬酸含量極少，可忽略不計，故分析剩余5種有機酸含量在濃縮過程中的變化。

為驗證方法的準確度和可靠性，采用與測定蘋果醋樣完全一致的方法，在最佳試驗條件下將蘋果原醋重復進樣8 次，測定有機酸的精密度，同時進行加標測定原醋中5種有機酸含量的回收率，即在原醋樣品中加入 225 μg/100 mL 的蘋果酸、500 μg/100 mL 的乳酸、6 000 μg/100 mL 的乙酸、80 μg/100 mL 的琥珀酸進行測定。結果見表1。

經測定，各有機酸加標回收率見表2。

由表2可知，各有機酸的回收率介于96.2 %～102.3%之間，相對標準偏差RSD（n=8）≤3.4%，表明該測定方法準確可靠，回收率高，重現性好。

蘋果醋兩級冷凍濃縮過程的變化見圖3。

由圖3可以看出在一級冷凍濃縮過程中料液濃度開始增加逐漸加快，到后期開始增加緩慢，說明此時的冷媒溫度與料液中心溫度差已經趨于平衡，溫差作為驅動力以不足以使濃縮較好的進行下去，同時冰環厚度的增加導致的傳熱效率降低，也不利于濃縮繼續進行，此時及時終止一級濃縮將料液從結晶罐底放出，低溫將夾帶冰溶解，開啟二級濃縮。同樣，二級濃縮前期料液濃度增加較快，隨著冷凍濃縮的進行料液濃度變化趨勢同一級濃縮。

圖2 7種蘋果醋處理液中5種有機酸含量高效液相色譜圖Fig.2 The high performance liquid chromatogram diagram about five kinds of organic acids content in seven kinds of different apple cider vinegar

表1 原醋中5種有機酸含量的精密度測定（n=8）Table 1 The precision of five kinds of organic acids content in the original vinegar（n=8）

表2 原醋中5種有機酸含量的加標回收率測定Table 2 Standard addition recovery rate determination of the five kinds of organic acids content in original vinegar

7種蘋果醋處理液中有機酸含量和冷凍濃縮過程復原液中有機酸含量變化見表3、圖4。

在蘋果醋中最主要的有機酸為乙酸，琥珀酸含量較少，經過兩級濃縮有機酸總損失率為3.45%。在兩級冷凍濃縮過程中，濃縮液復原后這5種有機酸含量都呈現出不同程度下降的趨勢，雖然過程樣液有機酸含量些許波動，但仍可見其下降趨勢。其中乙酸可以較明顯看出在第一階段中下降速率較緩慢，但在后期即第二階段則下降較快，可能是因為二級濃縮初始濃度較大，冰環生長過程中夾裹的乙酸分子要比一級濃縮多，導致二級濃縮過程中乙酸含量降低速率較大。

圖3 蘋果醋兩級冷凍濃縮過程濃度變化曲線圖Fig.3 The graph of concentration change of apple cider vinegar in two levels of freeze concentration processes

表3 7種蘋果醋處理液中5種有機酸含量匯總Table 3 Summaries of five kinds of organic acids content in the seven kinds of apple cider vinegar process modes

圖4 蘋果醋冷凍濃縮過程復原液中5種有機酸含量變化曲線圖Fig.4 The changing graph of the five organic acids content of apple cider vinegar recoveries in freeze concentration process

蘋果醋經過兩級濃縮復原后有機酸含量的損失率見表4，蘋果原醋經過一級冷凍濃縮后復原液中5種有機酸的保存率介于86.52%～95.77%之間，其中醋酸的保存率最高，達到95.77%；而經過兩級冷凍濃縮后復原液中5種有機酸的保存率則介于79.10%～88.71%之間，同樣是醋酸的保存率最高，達到88.71%。而終極夾帶的有機酸總損失率僅為3.00%，說明冷凍濃縮還是可以很大程度上保留原醋中有機酸的含量，尤其是含量較高的乙酸、D-蘋果酸。

二級濃縮由于被濃縮的基料濃度比一級濃縮的大，在濃縮過程中濃差極化現象也會更為明顯，這樣會導致溶質在夾帶冰中的濃度也會更大。由試驗結果也可知，二級夾帶和夾帶回收液濃度較高，有機酸含量也較高，仍有利用價值，針對這種情況，可考慮再次與原醋混合進行循環濃縮試驗，對濃度相對較低的一級夾帶冰則進行回收濃縮。而終極夾帶由于其0.1%的較低濃度，其中所含有機酸含量也微乎其微，建議舍棄不予回收。

表4 蘋果醋經過一級、二級濃縮復原后有機酸含量的損失率Table 4 The loss rate of the organic acid content in apple cider vinegar after primary and secondary concentration recovery

2.2 蘋果醋清除DPPH自由基能力

7種蘋果醋處理液中自由基清除能力見圖5。

圖5 不同處理方式的蘋果醋清除自由基能力Fig.5 Different treatments of apple cider vinegar ability of scavenging free radicals

濃度為5.0 %的蘋果原醋自由基清除能力為74.55%，同濃度的一級濃縮復原液和二級濃縮復原液的自由基清除能力分別為69.19%和67.24%。濃度為6.7%的二級夾帶自由基清除能力為75.30%，6.9%的夾帶回收液自由基清除能力為77.29%，這二者由于濃度高于原醋濃度所以自由基清除能力也高于原醋，一級夾帶和終極夾帶的清除率都在30%以下，終極夾帶的清除率17.66%已經非常弱了。由此可以看出蘋果原醋經過兩級濃縮后自由清除率僅降低了7.31%，產生的終極夾帶抗氧化性已很弱，說明冷凍濃縮是可以很好地保護蘋果醋中的抗氧化物質的。二級夾帶和夾帶回收液的高濃度也提高了自由基的清除能力，說明二級夾帶和夾帶回收液中仍有較強的抗氧化能力，具有較高利用價值，可與原醋混合繼續進行濃縮。

3 結論

蘋果原醋經過一級、二級冷凍濃縮后，蘋果酸、乳酸、乙酸和琥珀酸等有機酸含量有所降低，保留率介于79.10%～88.71%之間，主要有機酸乙酸僅損失3.03%，有機酸整體保留率在95%以上。終極夾帶的有機酸總損失率僅為3.45%，說明冷凍濃縮還是可以很大程度上保留原醋中有機酸的含量，尤其是含量較高的乙酸、D-蘋果酸。經過兩級濃縮后的復原液自由基清除率和原醋相比僅降低7.31%。得到的二級夾帶和夾帶回收液仍有較高的濃度和有機酸含量，且抗氧化能力也較高，仍有利用價值，針對這種情況，可考慮再次與原醋混合進行循環濃縮試驗，對濃度相對較低的一級夾帶則進行回收濃縮。而終極夾帶由于其0.1%的較低濃度，其中所含有機酸含量也微乎其微，抗氧化能力也很弱，可予以丟棄不必再次回收。