乳腺癌組織中cIAP1、XIAP和caspase-3的表達及其臨床意義

汪靈，吳至佛，鄧增艷，劉桂，劉君杰，黃俊輝

（中南大學 1.湘雅醫院 腫瘤科；2.湘雅口腔醫院 病理科，湖南 長沙410008）

乳腺癌是全球女性最常見的惡性腫瘤，而其發生機制尚未完全闡明，有研究[1-2]表明可能與細胞自噬和凋亡有關。細胞凋亡抑制蛋白（inhibitors of apoptosis proteins，IAPs）可通過影響細胞凋亡使腫瘤得以存活和增殖，是潛在的抗腫瘤治療靶點之一[3-4]。細胞凋亡抑制蛋白1（cellular IAP1，cIAP1）和X染色體連鎖凋亡抑制蛋白（X chromosome-linked IAP，XIAP）均屬IAPs家族，cIAP1參與了多種外在凋亡信號通路的轉導，XIAP蛋白是IAP家族成員中作用最強的半胱天冬酶（cysteinyl aspartate-specific protease，caspase）抑制劑[5]，雖然已發現兩者在多種腫瘤組織中高表達，但在乳腺癌中關于cIAP1和XIAP的研究相對較少。caspase家族是細胞凋亡級聯反應的真正執行者，caspase-3作為下游效應型caspase，是調控細胞凋亡的樞紐。探究caspase-3在乳腺癌中的表達可有效評估組織凋亡特性及其在腫瘤發生發展中的作用，caspase-3的表達水平與乳腺癌患者預后的關系尚存在爭議。文獻研究表明新輔助化療可能會改變乳腺癌的組織病理學特性或生物學因子的表達情況，而新輔助化療是否對蛋白表達與乳腺癌患者的預后關系產生影響仍需進一步研究。

本研究通過檢測乳腺癌組織、乳腺纖維腺瘤和正常乳腺組織中cIAP1、XIAP和caspase-3的表達情況，并結合乳腺癌數據庫中的患者資料，旨在探討3個凋亡相關蛋白與乳腺癌的臨床病理參數的聯系及其作為乳腺癌診斷和評估預后的生物學標志物的可行性。

1 材料與方法

1.1 研究對象

收集2016年9月—2018年9月于中南大學湘雅醫院診治的99例乳腺癌患者作為實驗組，采集其乳腺癌根治術術后標本?；颊吣挲g26～76歲，中位年齡48歲。其中50例患者既往接受過新輔助化療，49例患者術前未接受過任何腫瘤相關治療。實驗組中非浸潤性癌1例，特殊類型浸潤性癌4例，非特殊類型浸潤性癌94例；HER-2過表達型7例，Luminal A型11例，Luminal B型29例，三陰性乳腺癌（TNBC）52例。納入標準：⑴腫瘤原發于乳腺；⑵經病理學檢查確診為乳腺癌，有完整臨床病理資料；⑶KPS評分≥70分。排除標準：⑴合并其他類型惡性腫瘤；⑵遠處轉移。同時收集同期10例乳腺纖維腺瘤標本，及6例腫瘤邊緣5 cm以上的正常乳腺組織為對照。該研究方案經中南大學湘雅醫院倫理委員會批準。

1.2 免疫組織化學法檢測cIAP1、XIAP和caspase-3蛋白的表達

抗cIAP1抗體及抗XIAP抗體購自美國Abcam公司，caspase-3抗體購自美國Affinity公司。所有標本均采用EliVision免疫組化方法進行檢測。組織標本經石蠟包埋，連續切片，厚度約4 μm。60℃烤箱烤片1 h后脫蠟水化，切片在0.01 mol/L檸檬酸鈉緩沖液中（pH6.0）高溫高壓抗原修復，用3%H2O2孵育20 min阻斷內源過氧化物酶活性后，5%BSA封閉30 min，分別滴加cIAP1，XIAP和caspase-3一抗（工作液濃度均為1:100）4℃孵育過夜。在室溫下滴加HRP標記的抗兔IgG孵育50 min，隨后通過DAB顯色。蘇木精復染，脫水、封片。用PBS分別代替3種蛋白的一抗作陰性對照實驗。

1.3 染色結果判定

嚴格控制顯微鏡的攝片照明及參數設定條件一致，將組織切片放大200倍，隨機選取5個視野攝片，通過Image-Pro Plus 6.0對各蛋白表達情況進行定量分析。測量每個視野中目標組織的積分光密度及區域面積，計算平均光密度，取5個視野的平均值進行分析。

1.4 生物信息學分析

利用Kaplan-Meier Plotter數據庫，分別根據cIAP1，XIAP和caspase-3的表達量，選擇其最佳截斷值將納入的乳腺癌病例分為兩組，比較兩組乳腺癌患者的無復發生存期的差異，分析這3種蛋白的表達量和患者預后的關系。

1.5 統計學處理

應用SPSS 24.0對數據進行統計學分析，Kruskal-Wallis檢驗用于評估組間蛋白含量的差異；χ2檢驗，Fisher精確檢驗來分析組間各分類變量間的關系。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 cIAP1、XIAP和caspase-3在乳腺癌組織、乳腺纖維腺瘤和正常乳腺組織中的表達

在實驗組、良性對照組和正常對照組樣本中均可觀察到不同程度的cIAP1，XIAP和caspase-3蛋白的陽性表達，陽性染色為棕黃色或棕褐色顆粒。cIAP1陽性染色主要見于細胞質中；XIAP和caspase-3在細胞質和細胞核均可見表達，三者在乳腺癌中的表達情況見圖1。運用Image-Pro Plus對各組蛋白表達情況進行定量評估，分析發現，在乳腺癌組織中cIAP1、XIAP和caspase-3的表達水平均明顯高于正常乳腺組織中該蛋白的表達水平（均P＜0.05），而以上3種蛋白在乳腺癌組織和乳腺纖維腺瘤組織中的表達間無統計學差異（均P＞0.05）。根據患者接受根治性手術前有無行新輔助化療，將實驗組進一步分為化療組和未化療組。結果顯示，cIAP1、XIAP和caspase-3的表達水平在化療組和未化療組間無統計學差異（均P＞0.05）（表1）。

2.2 cIAP1、XIAP 及 caspase-3的表達和乳腺癌臨床病理參數的關系

為了探討cIAP1、XIAP及caspase-3的表達與乳腺癌臨床病理參數的關系，分別以cIAP1、XIAP和caspase-3平均光密度值的中位數為臨界值將99例乳腺癌患者分為高表達組和低表達組。cIAP-1、XIAP和caspase-3的高、低表達在不同腫瘤臨床病理參數患者中的分布情況見表2。結果顯示，cIAP1高表達的乳腺癌患者更集中于絕經前或年齡＜50歲的患者中（P＜0.05）；XIAP高表達的乳腺癌患者更集中于Ki-67＜20%的患者中（P＜0.05）；cIAP-1、XIAP和caspase-3的表達水平與其他臨床病理參數無關，其中包括ER、PR、HER-2狀態、分子分型等（均P＞0.05）。

2.3 cIAP1、XIAP 和 caspase-3表達與乳腺癌患者生存期的關系

利用Kaplan-Meier Plotter數據庫分析乳腺癌患者中cIAP1，XIAP和caspase-3的表達水平和預后的關系。結果顯示，cIAP1高表達患者的無復發生存期與cIAP1低表達者無統計學差異（P＞0.05），但進一步分組后發現在化療組中cIAP1高表達患者呈現出生存時間更長的趨勢（P=0.058）?？傃芯咳巳褐?，XIAP高表達患者的無復發生存期長于低表達者，進一步分組后發現，在化療組中XIAP高表達患者的無復發生存期較低表達組更長（均P＜0.05）?？傃芯咳巳褐信c未化療組中，caspase-3高表達患者的無復發生存期較短，預后較差（均P＜0.05）；而在化療組中caspase-3高表達組的無復發生存期較低表達組無統計學差異（P＞0.05）（圖2）。

表1 乳腺癌、纖維腺瘤及癌旁正常組織中cIAP-1、XIAP和caspase-3的表達量[×10-3，M（P25～P75）]Table 1 Expression levels of cIAP-1,XIAP and caspase-3 in breast cancer,breast fibroadenoma and normal mammary tissue[×10-3,M(P25-P75)]

表2 乳腺癌組織中 cIAP-1，XIAP和caspase-3表達情況與臨床病理參數的關系[n（%）]Table 2 Relations of expressions of cIAP-1,XIAP and caspase-3 with clinicopathologic parameters in breast cancer[n(%)]

圖2 乳腺癌組織中cIAP1、XIAP和caspase-3 蛋白的表達與預后的關系Figure 2 Relations of the expression of cIAP1,XIAP and caspase-3 proteins with prognosis of breast cancer

3 討 論

國際癌癥研究機構制定的GLOBOCAN 2018標準顯示，預計2018年全球約有208萬新發乳腺癌病例，該病的死亡人數為626679，乳腺癌仍然是威脅全球女性生命健康最高發的惡性疾病[6-7]。隨著乳房檢查、腫瘤標志物及鉬靶X線等檢查手段的廣泛運用，乳腺癌的檢出率得以提高，但仍有約40%的早期患者及大多數青年女性患者無法從中獲益，因此臨床亟待探尋高靈敏度、高特異性及準確率的乳腺癌診斷方法。

細胞凋亡是一種為維持內環境穩態的細胞自主的程序性死亡過程，凋亡信號的順利轉導有助于保護基因組穩定性，而細胞凋亡缺陷可能促使癌癥的發生，規避凋亡是腫瘤的發病機制之一[8]。IAPs家族可參與調節細胞凋亡并促進腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉移。在哺乳動物細胞中IAPs家族共有8位成員，既往研究顯示在肺癌，肝癌和卵巢癌等組織中cIAP1和XIAP均呈高表達，兩者亦被發現高表達于乳腺癌組織及其細胞系中。IAPs家族的N端均包含1個或3個桿狀病毒IAP重復結構域，該結構域可通過結合凋亡途徑中的關鍵蛋白酶—caspase的活性位點來發揮其生物學作用[9]。其中，cIAP1和XIAP可通過與caspase-3結合抑制凋亡，三者相互作用發揮著調控及效應細胞凋亡的職能。

3.1 cIAP1，XIAP 和 caspase-3在乳腺癌中高表達

本研究發現，相較于正常乳腺組織，cIAP1、XIAP和caspase-3在腫瘤組織中的表達水平更高。Pluta等[10]采用流式細胞術對乳腺癌組織中的cIAP1表達水平進行分析，結果顯示，相較于乳腺良性腫瘤，乳腺癌組織中cIAP1顯著高表達（P＜0.05）。Hussain等[11]通過測定中東地區乳腺癌中XIAP蛋白表達，研究結果示29.5%的乳腺癌組織呈XIAP高表達狀態；Xu等[12]運用組織微陣列技術對100例乳腺癌組織及70例配對正常乳腺組織進行胞質中XIAP蛋白表達情況的檢測，發現乳腺癌組織中的XIAP表達明顯高于正常對照組（P＜0.001）。Yang及其團隊[13]通過對來自21項研究的3091例患者的數據進行Meta分析，結果指出，既往多項研究發現乳腺癌組織中caspase-3蛋白表達明顯高于正常乳腺組織。綜合數據表明，以上3種凋亡相關蛋白在乳腺癌中均有上調趨勢，提示其異常表達可能破壞了細胞增殖與凋亡的動態平衡，阻滯了腫瘤細胞的凋亡進程，使腫瘤細胞得以存活和增殖，進而促使乳腺癌的發生、發展。

3.2 cIAP1，XIAP 和 caspase-3與臨床病理參數的關系

乳腺癌是一種激素反應性腫瘤，其發生、發展和預后與體內性激素的分泌，特別是雌、孕激素和雄激素的水平密切相關。月經是雌、孕激素作用于子宮內膜后引起的周期性出血，是卵巢功能的外在表現，女性月經狀態可在一定程度上反映機體內分泌水平。研究顯示，雄激素作為合成雌激素的前體，其在絕經前[14]及絕經后[15]婦女體內的激素水平均與乳腺癌發生風險存在正相關，反映月經狀態可能與乳腺癌的發生發展有關。本研究發現絕經前乳腺癌患者中高cIAP1表達水平的患者比例較高，推測cIAP1的表達水平可能與患者月經狀態有關。

Ki-67被廣泛用于評估腫瘤的增殖活性，除G0期外，它存在于細胞周期的各個階段。參考St.Gallen標準[16]，本研究以20%作為Ki-67的臨界值，發現在Ki-67＜20%的乳腺癌患者中，高XIAP表達水平的患者比例較高；Wang等[17]發現XIAP的高水平表達與增殖指數相關，本研究結果與其結果相符，提示XIAP不僅參與細胞凋亡的調節，還可能與細胞增殖有關。

本研究未發現caspase-3與年齡、月經狀態、ER、PR、HER-2及Ki-67等臨床病理參數相關，該結果與既往其他研究類似[18]；此外，也有文獻[19]報道乳腺癌中caspase-3的高表達與腫瘤組織中ER、PR、Her-2的陽性狀態相關。結果的差異可能因研究人群、腫瘤異質性、caspase-3陽性臨界值等不同而造成，上述結論有待于后續大樣本的隨機對照試驗進行驗證。

TNBC作為乳腺癌的一種特殊亞型，具有侵襲性強、易局部復發轉移等特性，因其獨特的生物學行為成為臨床難點之一[20]。TNBC約占乳腺癌總體發病率的15%左右，本研究為探討cIAP1、XIAP和caspase-3的表達在非TNBC與TNBC中是否存在差異，特增加TNBC病例數。研究結果示，3種凋亡相關蛋白的表達在非TNBC和TNBC間無統計學差異（P＞0.05）。

3.3 cIAP1，XIAP和caspase-3的潛在臨床價值

cIAP1的C-末端攜帶具有E3泛素連接酶的功能的RING（really interesting new gene）結構域，它能夠通過泛素蛋白酶體途徑降解目標蛋白并參與多種凋亡通路的信號轉導。本研究發現在接受新輔助化療的乳腺癌患者中cIAP1高表達患者的無復發生存期可能更長。Kempkensteffen等[21]認為cIAP1的高表達與腎細胞癌的良好預后相關；研究[22]發現下調cIAP1與尿路上皮癌細胞系的凋亡相關；然而也有研究[23]結果顯示，cIAP1高表達是膀胱癌患者的不良預后因素。以上結果揭示cIAP1的表達可能與腫瘤預后存在相關性，但在不同腫瘤類型中其表達及意義存在差異，其相關機制有待進一步闡明。

XIAP是IAPs家族中最有潛力的成員，它可以直接結合caspase-3，caspase-7和caspase-9從而抑制caspase的蛋白水解活性來發揮抗凋亡的作用[24-25]。利用其抗細胞凋亡的特性，通過運用XIAP反義寡核苷酸和小分子抑制劑治療腫瘤的新療法成為了研究熱點，相關試驗已進入臨床前研究和I、II期臨床試驗階段[26-28]。誠然更多的研究致力于探討XIAP對乳腺癌進展和化療耐藥方面的影響，而XIAP與乳腺癌的預后關系于臨床治療的指導仍有意義。本研究發現，XIAP對評估化療后患者的預后可能存在參考價值，在化療組中，XIAP高表達患者的無復發生存期較長，預后較好。Nestal de Moraes等[29]發現XIAP的高表達與乳腺癌患者的不良臨床結局相關，本研究與該結論相反。Tamm等[30]在早期的研究中通過對76例原發性急性髓系白血病患者的XIAP表達情況及預后進行分析，發現高XIAP蛋白表達組的中位生存期及中位緩解時間較低表達組更短，即高XIAP蛋白水平可能與急性髓系白血病患者的生存率存在負相關。而其團隊在后續的研究中，通過擴大試驗樣本量（n=172）發現這一相關性并不成立，考慮結果上的差異可能與疾病所處階段及接受的治療方案不同有關[31]。Ferreira等[32]通過免疫組化分析144例非小細胞肺癌患者XIAP的表達與預后關系時指出，XIAP高表達的患者其總生存期更長。為進一步探討出現這一現象的原因，通過檢測凋亡指數與增殖指數（如：有絲分裂指數和Ki-67陽性細胞百分率）研究細胞的凋亡及增殖情況，發現XIAP的表達水平與凋亡指數無明顯相關性，而XIAP的高表達與低腫瘤增殖指數相關。

由于細胞的凋亡作用主要通過激活caspase-3來實現，因此檢測乳腺腫瘤中凋亡效應因子caspase-3的表達能準確地反映其在腫瘤發生、發展中的作用。大量研究表明caspase-3的表達與乳腺癌密切相關，而caspase-3的表達水平與患者的預后關系在仍有爭議。既往研究報道caspase-3的高表達與乳腺癌患者的不良預后相關[33-34]，而部分研究得到相反的結論，即caspase-3表達的下調與腫瘤發展、侵襲和轉移存在相關性[35]。本研究發現，在總研究人群中，caspase-3高表達患者的無復發生存期較短，預后較差。與文獻報道的結果一致[36]：高表達水平的caspase-3與進展期乳腺癌患者腫瘤復發及存活率下降相關。caspase-3通常以無活性的酶原前體形式存在于細胞質中，一旦被激活為活化型caspase-3，細胞則進入了不可逆轉的凋亡級聯反應。研究表明，經放、化療等抗腫瘤治療后，細胞凋亡通路被激活引發凋亡，瀕死的腫瘤細胞可通過旁分泌途徑釋放鈣非依賴性磷脂酶A2（calcium-independent phospholipase A2，iPLA2）等介質，從而改變腫瘤周圍微環境引發“鳳凰涅槃”現象，刺激殘存腫瘤細胞再增殖。caspase-3作為caspase-3/iPLA2或caspase-3/Pannexin 1“鳳凰涅槃”信號通路的樞紐，活化的caspase-3可通過釋放大量炎癥介質進而促使腫瘤復發和轉移。通過進一步的分析發現，在化療組中caspase-3高、低表達組間的無復發生存期未表現出明顯差異，而在未化療組中caspase-3高表達患者的生存時間較短，反映總人群中兩組間的差異主要集中在未化療的患者，推測caspase-3對既往未接受過任何抗腫瘤治療的患者的預后判斷更有價值。

本研究通過對實驗組進行亞組分析，發現cIAP1、XIAP和caspase-3的表達在未化療組和化療組間、非TNBC組和TNBC組間均無統計學差異（均P＞0.05）。結果提示化療可能不影響目標蛋白在乳腺癌患者中的表達，化療前后的穩定表達使得靶蛋白作為乳腺癌潛在生物標志物成為可能。因本研究存在地域局限性，且入組病例數有限，尚需大樣本隨機試驗驗證文中觀點。

綜合本研究的結果表明，cIAP1、XIAP和caspase-3蛋白表達可能與乳腺癌的發生、發展相關，提示XIAP和caspase-3可作為判斷乳腺癌預后的潛在指標，其中，XIAP適用于新輔助化療后患者的預后評估，caspase-3有益于未接受化療的患者的預后評價，但其實際的臨床應用價值仍有待在更大的樣本中探明。隨著腫瘤分子醫學的發展，人們對乳腺癌研究的逐漸深入，疾病診治轉向規范化和精準化。尋找可靠的生物標志物不僅能發掘乳腺癌早期篩查和診斷的新指標,同時還具有指導乳腺癌靶向治療及評判預后的作用，對IAPs家族的進一步了解有望為乳腺癌的診治提供新的思路。