維生素D受體啟動子DNA異常甲基化水平與視神經脊髓炎譜系疾病的關系☆

牟茂 徐竹 賀電 邵冰 吳欽華 蒙延筱 朱俊羽 楚蘭○☆

視神經脊髓炎譜系疾病 （neuromyelitis optica spectrum disorders，NMOSD）是自身免疫介導的主要累及視神經和脊髓的中樞神經系統炎性脫髓鞘疾?。╥nflammatory demyelination diseases in central nervous system，IDDCNS）[1]。 病因及發病機制仍不清楚，目前越來越多的研究提示表觀遺傳在IDDCNS的發病中也起著關鍵作用，特別是作為表觀遺傳最具有代表性的DNA甲基化[2-3]。有研究顯示，維生素 D（vitamin D，VD）可以從表觀遺傳學影響 IDDCNS的發病[4]。VD除了熟知的調節鈣磷代謝外，在維持固有免疫和獲得性免疫功能平衡中也起著不可忽視的作用[5-8]。NMOSD的發病機制之一為免疫平衡被打破，鑒于VD具有調節免疫平衡的作用，對缺乏VD的NMOSD患者單獨補充VD后，卻發現不能對疾病起到很好的保護作用[9]。針對臨床上遇到的問題，有必要對介導VD發揮生物學作用的VDR進行研究，近年來關于VDR DNA的研究多集中在基因多態性上，目前尚未見到關于NMOSD VDR啟動子DNA甲基化的研究?；谝陨显?，我們做出如下實驗：通過亞硫酸氫鹽測序法對NMOSD患者VDR啟動子DNA甲基化水平進行檢測，并探討VDR啟動子DNA甲基化狀態與NMOSD及其殘疾程度的相關性。

1 對象與方法

1.1研究對象收集2017年7月至2018年10月就診于貴州醫科大學附屬醫院的NMOSD患者作為研究對象。入組標準：①符合2015年國際NMO診斷小組修訂的診斷標準[10]；②在入組前2個月內未補充VD的NMOSD患者；③采集標本前2個月內未使用糖皮質激素或其他免疫抑制劑的NMOSD患者；④年齡18至70歲。排除標準：①其他系統性自身免疫性疾病如甲狀腺疾病、系統性紅斑狼瘡，類風濕關節炎等；②顱內感染或其他感染性疾病急性期；③骨代謝異常的患者。

納入我院體檢中心體檢的年齡、性別相匹配的健康人群作為健康對照組。該研究獲得貴州醫科大學倫理委員會的批準，所有研究均經過患者同意并簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1DNA及RNA提取 所有研究對象于清晨空腹采集5 mL乙二胺四乙酸 （EDTA）抗凝血，分別用核酸磁珠提取試劑盒（海貍，中國）及Trizol法提取PBMC中的DNA及總RNA。

1.2.2亞硫酸氫鹽測序法（bisulfite sequencing PCR，BSP）檢測VDR啟動子 DNA甲基化水平取 200～500 ng DNA 用 EZ DNA Methylation Direct試劑盒（Zymo Research，美國）進行亞硫氫酸鹽處理，取經亞硫酸氫鹽處理后的DNA用巢氏PCR擴增，引物序列及退火溫度見表1。取擴增后的PCR產物與pGEM-T載體（Promega，美國）連接后轉入DH5α感受態細胞中進行克隆，每個樣本挑選10個陽性克隆子進行測序。測序由上海生物技術有限公司完成。

1.2.3實時熒光定量PCR（RT-QPCR）檢測VDR mRNA表達 根據逆轉錄試劑盒（Takara，日本）說明書將總RNA逆轉錄成cDNA，再以cDNA為模板在ViiA7Dx實時熒光定量PCR儀（ABI，美國）中檢測VDR mRNA表達。引物序列及退火溫度見表1。

表1 引物序列及退火溫度

1.3 統計學方法應用SPSS 18.0進行數據分析，符合正態分布的計量資料以x±s表示，采用獨立樣本t檢驗；不符合正態分布的計量資料以中位數和四分位數間距表示，采用秩和檢驗。計數資料以率表示，采用χ2檢驗。NMOSD及其疾病殘疾程度危險因素分析用logistic回歸模型。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 一般資料本研究共納入急性期NMOSD患者39 例，男 11 例，女 28 例，平均年齡（37.1±2.1）歲?；颊?EDSS 評分在 1～6.5 分之間，平均（2.4±1.8）分。健康對照組16例，男6例，女10例，平均年齡（35.2±2.9）歲。 兩組性別（P=0.78）、年齡（P=0.63）差異無統計學意義。

根據EDSS評分將NMOSD組分為輕度組（EDSS≤2.5分，28 例）和中重度組（EDSS＞2.5 分，11例），因重度組患者僅1例，故將中度組和重度組合為中重度組。

2.2 VDR啟動子DNA甲基化水平與健康對照組相比，NMOSD組VDR啟動子甲基化水平（0.10±0.07）較健康對照組（0.12±0.35）低，但差異無統計學意義（P＞0.05）。分別比較測序的 19個 CPG位點的DNA甲基化水平發現，有12個CPG位點的DNA甲基化水平較對健康照組低，但僅CPG-3及CPG-5位點DNA甲基化差異具有統計學意義（P＜0.001，P=0.045）。 健康對照組在 CPG-3 及CPG-5位點的DNA甲基化水平分別是NMOSD組的7倍和2倍（見表2）。

以NMOSD組及健康對照組作為因變量，將19個CPG位點作為協變量，進行單因素logistics回歸分析顯示，CPG-3及CPG-5位點的P值小于0.1，將上述位點同時作為協變量進行多因素logistics回歸分析發現：CPG-3位點低甲基化水平可能與NMOSD相關（OR=0.272，95%CI:0.112～0.662，P=0.004）（見表 4）。

此外，我們分析了NMOSD組的輕度組與中重度組VDR啟動子DNA甲基化的差異 （見表3），發現在CPG-14位點，重度組的DNA甲基化水平是輕度組的5倍，差異具有統計學意義（P=0.044）。

以輕度組及中重度組作為因變量，將19個CPG位點作為協變量，進行單因素logistics回歸分析顯示，CPG-11及CPG-14位點的P值小于0.1，將上述位點同時作為協變量進行多因素lo gistics回歸分析發現：CPG-14位點的高甲基化水平可能與NMOSD疾病殘疾程度相關（OR=4.013，95%CI:1.01～15.92，P=0.048）（見表 4）。

表2 NMOSD組與健康對照組甲基化水平

表3 NMOSD組的輕度組與中重度組DNA甲基化水平

表4 NMOSD及其殘疾程度危險因素分析

2.3 VDR mRNA表達水平與健康對照組相比，NMOSD組VDR mRNA上調了1.9倍（P=0.001）。此外，我們分析了VDR mRNA水平與年齡和EDSS之間的關系，以及與性別之間的差異，無統計學上的顯著相關及差異（P＞0.05）。

3 討論

盡管DNA甲基化參與了眾多疾病的發生發展[11-14]，但目前關于NMOSD DNA甲基化的研究甚少，關于NMOSD VDR啟動子的DNA甲基化研究更是尚未見報告。本研究發現NMOSD患者VDR啟動子的DNA甲基化水平較健康對照組低，且VDR mRNA表達水平增高。提示DNA甲基化參與了NMOSD的發生，這與我國趙俊杰等[15]的報告相似，該研究也提出DNA甲基化參與了NMOSD的發生，國外未見相關報告。本研究顯示NMOSD患者VDR啟動子DNA甲基化水平稍低于健康對照，DNA甲基化是機體調節基因表達的一種機制，受多種原因的影響，根據以往文獻報道：在自身免疫性疾病如多發性硬化，類風濕關節炎等的研究中，發現一些基因在疾病的急性期呈低甲基化改變[16-18]，據此我們推測 VDR啟動子DNA甲基化改變的原因可能是由于NMOSD的炎癥反應參與了VDR啟動子DNA甲基化改變，后期我們將納入緩解期的NMOSD患者以證明這種猜想。此外關于VDR啟動子DNA甲基化改變的原因，還可能與VD降低后，機體通過DNA甲基化調控機制上調VDR表達，以增加與VD的結合，這個推測在兩項關于青少年的研究中得到證實：VD缺乏導致包括VDR啟動子在內的全基因組DNA呈低甲基化改變[19-20]。但是補充VD是否會改善VDR的DNA甲基化狀態還需進一步的研究。

VDR啟動子DNA甲基化的研究多限于腫瘤，本研究首次報道了NMOSD患者VDR啟動子DNA甲基化。在本研究測序的VDR-800 bp～-506 bp區域中，共有19個CPG位點，經多因素logistics回歸分析發現：VDR啟動子CPG-3位點的低甲基化水平可能與NMOSD相關（OR=0.272，95%CI:0.112～0.662，P=0.004）。NMOSD 組的 390個克隆中，僅7個（1.79%）克隆在CPG-3位點是甲基化的，且僅5例（12.8%）在此位點有甲基化。而在健康對照組的160個克隆中，有23個（15.63%）克隆在CPG-3位點是甲基化的，有10例（62.5%）在此位點有甲基化。

在輕度組與中重度組中經多因素logistics回歸分析發現，CPG-14位點的高甲基化水平可能與NMOSD殘疾程度相關（OR=4.013，95%CI:1.01～15.92，P=0.048）。在輕度組中的280個克隆中，僅8個（2.86%）克隆是甲基化的，僅3例（10.7%）在此位點有甲基化。而中重度的110個克隆中，有21個（19.09%）克隆是甲基化的，有7例（63.6%）在此位點有甲基化。由此可見，健康對照與NMOSD患者在CPG-3位點的甲基化分布、輕度組與中重度組在CPG-14位點的甲基化分布是有明顯差異的。

本研究為以后關于NMOSD VDR啟動子的DNA甲基化研究提供了一定的基礎，待多中心大樣本的研究進一步驗證本研究結果后，可以對NMOSD的診療提供一定的幫助，同時也為尋找新的潛在治療靶點提供依據。

本研究不足之處：①樣本量?。菏紫扔捎谘芯繉ο髮儆诤币娂膊?，發病率少，其次選取樣本的時間及范圍限制，導致最終納入的樣本偏??；②在CPG-14位點的logistic回歸分析中，P=0.048，95%CI：1.011～15.924，P值接近 0.05，可信區間稍寬，可信度偏低，更準確的結果還期待多中心，大樣本的研究；③本研究未能納入緩解期的NMOSD患者。在接下來的研究中，我們會進一步擴大樣本量，并納入緩解期的NMOSD患者，以期得出更為詳實的結果。