節律相關基因CRY2、ARNTL多態性與選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑療效的關聯研究

馬惠瑩 徐一凡 劉志芬 胡曉東 孫寧 李忻蓉 王彥芳 張克讓○☆

重性抑郁障礙（major depressive disorder，MDD）是一種常見的高遺傳度復雜疾病，目前已成為全球第二大致殘疾病[1]。既往大量研究表明，生物節律紊亂會使重性抑郁障礙發病風險升高，并且睡眠—覺醒周期紊亂、情緒改變、晨重暮輕等是重性抑郁障礙患者常見臨床癥狀，而以重建生物節律為目標的睡眠剝奪療法、光照療法等可在短時間內改善抑郁癥狀[2-4]。眾多周期性表達的節律性基因是生物節律形成和維持的基礎[5]。在節律性基因振蕩反饋的控制環路中，隱花色素2基因（cryptochrome 2,CRY2）及芳烴核受體類轉運體基因（aryl hydrocarbon receptor nuclear translocatorlike，ARNTL）產物作為起始激發和反饋抑制的重要組成部分，有著不可替代的作用[6]。目前基礎及臨床研究均發現CRY2及ARNTL基因多態性與抑郁障礙發病[7-9]及臨床癥狀[10-11]有關，但未見關于此二基因多態性與臨床常見抗抑郁藥療效及副反應關聯的研究報道。本研究以中國漢族重性抑郁障礙患者為研究對象，對節律性基因CRY2 rs10838524位點及ARNTL rs2278749位點多態性與5-羥色胺再攝取抑制劑（selective serotonin reuptake inhibitors，SSRIs）療效、副反應及臨床癥狀的關聯性進行探討，試圖尋找相關的生物學標記，并為個體化抗抑郁治療提供生物學預測指標。

1 對象與方法

1.1 研究對象收集2015年4月至2017年8月山西醫科大學第一醫院精神衛生科門診及住院重性抑郁障礙患者。納入標準：①年齡18～65歲，漢族，性別不限；②符合《美國精神障礙診斷與統計手冊第四版》（Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders,Fourth Edition,DSM-Ⅳ）重性抑郁障礙診斷標準，通過簡明國際神經精神訪談問卷 （Mini-International Neuropsychiatric Interview,MINI）證實診斷；③首發、復發均可，從未或近14 d未使用抗抑郁藥物治療；④17項漢密爾頓抑郁量表（17-item Hamilton depression scale，HAMD17）總分≥17。排除標準：①患有嚴重的心、肝、腦、腎等器質性疾病，遺傳性疾病，或患有其他精神障礙者；②妊娠期或哺乳期女性；③有嚴重消極自殺觀念者；③對SSRIs類藥物過敏者。共收集537例患者，其中完成6周SSRIs抗抑郁治療者319例，脫落218例（其中失訪者85例，因不能耐受藥物不良反應而退出者63例，未規律服藥及自行停藥者29例，合并使用抗精神病藥物者15例，治療過程中伴發軀體疾病者26例）。

本研究獲山西醫科大學第一醫院倫理委員會審核批準。所有受試者均簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1藥物治療 患者入組后給予一種SSRIs類抗抑郁藥物（包括艾司西酞普蘭、西酞普蘭、帕羅西汀、舍曲林、氟西?。┲委?周。以每種藥物的最低治療劑量為初始劑量：艾司西酞普蘭10 mg/d，西酞普蘭20 mg/d，帕羅西汀20 mg/d，舍曲林片50 mg/d，氟西汀片20 mg/d。2周內增至治療量，根據患者病情可酌情增減劑量?？珊喜⑹褂帽蕉愃幬?，但不合并使用其他抗抑郁藥物、抗精神病藥及情感穩定劑。

1.2.2量表評估 使用一般情況問卷收集患者性別、年齡、婚姻、家族史等資料。采用HAMD17量表評估患者臨床癥狀和療效，該量表由焦慮/軀體化、阻滯、睡眠障礙、Maier、體重、核心、認知障礙等7種癥狀群因子構成。用不良反應量表（treatment emergent symptom scale，TESS） 或 UKU 副作用評定量表（UKU side effect rating scale，UKU）評估治療過程中副反應的發生情況，其中358例患者使用TESS量表進行評估，179例患者使用UKU量表進行評估。本研究在基線、治療第2周末、第4周末及第6周末評估患者的抑郁嚴重程度和副反應情況。由2名專業心理測量師進行量表評估，HAMD17、UKU、TESS一致性檢驗Kappa值分別為0.81、0.76、0.68（對 100 名患者評估所得）。

1.2.3療效評定 以第6周末HAMD17總分減分率作為療效評價指標，總分減分率≥50%為有效，＜50%為無效。減分率=（基線總分-治療后總分）/基線總分×100%。

1.2.4基因型檢測 所有受試者采集肘靜脈血5 mL，酚氯仿法提取DNA，采用聚合酶鏈式反應（PCR）和PCR產物直接測序法，對CRY2 rs10838524位點及ARNTL rs2278749位點進行基因分型。使用Primer 5.0軟件設計引物，引物由深圳華大基因公司合成。rs10838524上游引物 5’-AGCTTCTTC TAGAAGCAGGC-3’， 下游引物 5’-CCTGAACAG GACGTGGGTAA-3’；rs2278749上游引物 5’-GCG ATTGGTGGGCGGGGGGC-3’，下游引物 5’-CGGG CCTGGGCCGGCGGGGA-3’。PCR反應體系為25μL，含有 60 ng DNA，2.5 μL dNTPs（2 mmol/L）。 PCR擴增反應條件：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35個循環；最后72℃延伸10 min，PCR產物4℃保存。使用美國ABI PRISM 3700DNA自動測序儀，利用雙脫氧核苷酸末端終止法進行PCR產物的序列分析。

1.3 統計學方法數據采用SPSS 19.0進行統計分析。應用擬合優度χ2檢驗進行Hardy-Weinberg（HW）遺傳平衡吻合度檢驗。治療有效組與無效組間一般資料比較采用獨立樣本t檢驗或χ2檢驗；兩組間基因型分布比較及不同基因型患者間副反應發生情況比較采用χ2檢驗；不同基因型患者間基線期HAMD17各因子得分比較，采用單因素方差分析（one-way ANOVA）。以假陽性錯誤率（false discovery rate，FDR）法對結果進行多重校正。檢驗水準α=0.05，雙側檢驗。

2 結果

2.1 社會人口學特征和臨床資料完成治療的319例患者中，268例治療有效 （84.0%），51例無效（16.0%）。在年齡、性別、婚姻狀況、家族史、基線期HAMD17總分方面，治療有效組和無效組之間差異無統計學意義（P＞0.05）。有效組6周末HAMD17總分低于無效組，差異有統計學意義（t=14.540，P＜0.001）。 見表 1。

2.2 遺傳平衡吻合度檢驗本研究對象中CRY2基因rs10838524位點（χ2=0.218，P=0.897）及ARNTL基因rs2278749位點（χ2=0.004，P=0.998）的基因型分布均符合H-W遺傳平衡（P＞0.05）。

2.3CRY2基因rs10838524位點及ARNTL基因rs2278749位點多態性在治療有效組與無效組之間，CRY2基因rs10838524位點及ARNTL基因rs2278749位點各基因型分布差異均無統計學意義（P＞0.05）。 見表 2。

表1 SSRIs抗抑郁治療有效與無效組社會人口學特征和臨床資料

表2 SSRIs抗抑郁治療有效組與無效組各基因型分布

2.4各基因型患者基線期抑郁癥狀CRY2基因rs10838524位點各基因型患者基線期HAMD17總分及各因子分差異無統計學意義（P＞0.05）。ARNTL基因rs2278749位點各基因型患者基線期HAMD17總分及各因子分差異也無統計學意義 （P＞0.05）。見表3。

2.5 各基因型患者SSRIs治療過程中副反應治療過程中出現的副反應主要集中在消化系統、中樞神經及植物神經系統，多數為輕度，少數為中度，未發生嚴重不良反應。ARNTL基因rs2278749CT+TT基因型患者相對于CC基因型更易發生腹瀉 （χ2=4.725， 校正后P=0.042，OR=1.91,95%CI:1.06 ～3.45）及頭暈（χ2=4.288，校正后P=0.048,OR=1.55， 95%CI:1.02～2.35）副反應。未發現CRY2基因rs10838524位點各基因型患者發生副反應的差異具有統計學意義（P＞0.05）。見表4。

3 討論

生物節律存在于地球上幾乎所有生物體中，是生物體適應外界環境和自我保護的重要機制[12-13]。在人體中，受周期性信號的刺激，生物節律基因經過層級信號傳遞形成周期性振蕩的反饋控制環路[14]，而基礎研究表明CRY2基因與ARNTL基因在反饋控制環路的形成與振蕩中起著重要作用[15-16]。在環路起始，由ARNTL基因轉錄翻譯形成異質二聚體，激活CRY2等基因轉錄翻譯，并進一步激活下游基因形成層級擴大的轉錄翻譯事件，而CRY2基因轉錄翻譯形成的大量異質二聚體又會逆向抑制ARNTL基因激活，進而減弱CRY2等基因激活，最終形成反饋控制環路[6]。

CRY2和ARNTL基因分別位于人類11號染色體的長臂11p11和11p15。目前在此二基因多態性與抑郁障礙關聯性的研究報道中，關于CRY2 rs10838524位點及ARNTL rs2278749位點的研究較多。動物實驗發現，抑郁模型小鼠的CRY2基因表達顯著降低[17-19]。在針對高加索人群的研究中發現，CRY2 rs10838524位點A等位基因很可能是抑郁障礙發病的危險因子[20-22]，ARNTL rs2278749位點多態性與晝夜紊亂癥狀及抑郁障礙發病均具有顯著關聯性[23-24]。但目前并未發現此二基因多態性與臨床常見抗抑郁藥療效及副反應的關聯研究報道，僅有2010年LAVEBRATT等[7]在臨床研究中，根據睡眠剝奪治療后CRY2mRNA水平的變化，提出CRY2基因多態性可能是反映抗抑郁療效的特征性標志。

表3各基因型患者基線期HAMD17各因子得分

表4各基因型患者發生副反應情況

基礎研究發現，臨床常用抗抑郁劑SSRIs所作用的5-羥色胺系統，與生物節律系統及情感障礙相關的神經回路，在解剖學和分子水平上廣泛聯系，并且這些系統在情緒和生理行為的調節上可能相互融合[4,25]。臨床研究發現，以氟西汀、氟伏沙明為代表的SSRIs類抗抑郁藥物很可能是通過調控生物節律而發揮抗抑郁療效[26-27]。該結論曾在日本人群中得到證實[26]，但尚未在中國人群中發現相關報道。

本研究以中國漢族重性抑郁障礙患者為研究對象，通過6周的SSRIs抗抑郁治療，試圖探究CRY2rs10838524位點及ARNTLrs2278749位點多態性與SSRIs抗抑郁療效的關聯性。然而在6周末治療有效組與無效組之間，CRY2rs10838524位點及ARNTLrs2278749位點各基因型分布差異均無統計學意義（P＞0.05），這提示CRY2 rs10838524位點及ARNTL rs2278749位點多態性與中國漢族重性抑郁障礙患者SSRIs抗抑郁療效可能無關。但本研究中合并用藥、軀體合并癥、不耐受副反應及患者依從性等因素造成較高的脫落率，會對研究結果的穩定性造成一定影響，并且本研究并未依據患者年齡、性別進行分層分析，也并未排除環境影響、交互作用等混雜因素，因此本研究關于相關基因多態性與療效關系的結論，仍需未來在更大樣本量及盡可能純化樣本的基礎上進一步研究證實。2015年SAVALLI等[19]通過對小鼠行為觀察發現節律性基因可能與抗抑郁劑的長期療效相關，而本研究較短觀察期或許無法揭示節律性基因與長期療效的關系。

本研究發現節律相關基因CRY2 rs10838524位點及ARNTL rs2278749位點多態性可能與重性抑郁障礙的焦慮/軀體化癥狀、阻滯癥狀、睡眠障礙癥狀、Maier癥狀、體重減輕癥狀、核心癥狀、認知障礙癥狀無關。由于HAMD17量表評估內容的限制，未對睡眠紊亂及晝夜變化癥狀進行深入分析，或許是造成本研究與既往研究結果不一致的原因。ARNTL基因rs2278749位點多態性可能與使用SSRIs抗抑郁治療過程中是否出現腹瀉及頭暈副反應有關，其中攜帶T等位基因的患者風險較高。CRY2基因rs10838524位點多態性可能與使用SSRIs抗抑郁治療過程中出現的副反應無關。上述結果可為將來深入研究個體化及精準化的抗抑郁治療提供部分理論依據。

本研究不足之處在于脫落率較高，數據收集不充分，分組后例數過少，隨訪時間較短，未能觀察長期療效，以及療效的穩定性及其與相關基因多態性的關聯性仍需繼續觀察，因此對本研究療效結果的推斷仍應謹慎。并且本研究也未考慮到基因的連鎖不平衡、基因交互作用及基因與環境之間的交互作用。未來應在擴大樣本量、充分收集數據的基礎上進行深入研究，以進一步證實本研究的結論。