內皮素-1基因多態性與腦出血的關系及其對血壓的影響☆

易袁晶 魏雪利 馬明明

劉寶瓊△ 胡治平** 肖波△ 曾藝*○☆

研究發現長沙地區腦出血年平均發病率為131.0/10萬，腦出血占腦卒中的比例為55.4%，遠高于世界平均水平，其中79.8%腦出血患者患有高血壓病[1]。在長沙漢族人群研究中，證實遺傳因素與腦出血發病有關[2-4]。近期研究表明，腦出血急性期人體ET-1血漿水平升高，且與顱內血腫大小成正相關[5]，提示ET-1可能參與腦出血的發病。ET-1基因單核苷酸多態（single nucleotide polymorphisms,SNPs）已被證實參與了包括高血壓、動脈粥樣硬化在內的多種人體疾病發生、發展的病理過程[6]。本研究擬利用長沙漢族人群研究ET-1基因兩個常見 SNPs（rs5370、rs1800541）與腦出血的關系，并探討對其血壓的影響。

1 對象與方法

1.1 研究對象選取2006年1月至2009年12月于湘雅醫院就診的腦出血患者作為研究對象，收集其臨床資料和外周血標本。納入標準：①年齡≥18歲；②湖南省長沙地區漢族人；③頭顱CT平掃和/或頭顱MRI平掃證實為急性腦出血，且符合第四屆全國腦血管病學術會議診斷標準[7]；④發病至住院時間≥14 d。排除標準：①外傷、藥物、動脈炎、腫瘤、腦血管畸形或動脈瘤引起的腦出血病例；②混合型腦血管?。üＫ篮蟪鲅虺鲅蠊Ｋ溃┑牟±?；③肝腎功能障礙、血液病及溶栓治療接受者、甲狀腺疾病、自身免疫型疾病及妊娠者。

隨機選取同期在中南大學湘雅醫院的健康體檢人員作為對照組，收集其臨床資料和外周血標本。納入標準：①年齡≥18歲；②湖南省長沙地區漢族人。排除標準：①腦血管病、血液病、肝腎疾病、甲狀腺疾病、自身免疫性疾病、及妊娠者；②無腦血管病家族史。

腦出血組、對照組成員均無血緣關系，并簽署知情同意書。研究方案通過醫學倫理委員會批準。

1.2 血清標本的采集研究對象禁食12 h，次日清晨7時至 8時采外周靜脈血 10 mL，取 5 mL（不抗凝）靜置 1 h，2000 r/min常溫離心后分離血清，將血清置于4℃冰箱保存，用于血脂測定，其余5 mL（肝素抗凝）用于DNA制備。

1.3 收縮壓、舒張壓和平均動脈壓的測定測量腦出血患者入院時、發病1周后和發病2周后血壓，3次血壓均超過140 mmHg/90 mmHg、發病之前確診過高血壓病或者口服高血壓藥物者診斷為臨床高血壓病。將腦水腫高峰期前或者高峰期過后的血壓水平進行記錄。

1.4 基因分型利用常規酚/氯仿抽提法提取基因組DNA。用于擴增ET-1基因兩個SNPs位點的PCR引物序列經Primer 3.0設計，由上海生工公司合成。引物序列：rs5370F AAGAGTTGCGGCGGGTGGT，rs5370R AATGTGCTCGGTTGTGGGTCA；rs1800541F GGCATCCCCTGGGAAGAGA CT，rs1800541R TGCATGGAACACATTGGCTTTT。 PCR 反應條件：96 ℃預變性 15 min；96 ℃ 10 s，50℃ 5 s，60 ℃ 30 s，28個循環；60℃延伸1 min。根據美國ABI公司的操作說明采用SAP/ExoⅠ酶法對PCR產物進行純化。根據SNP上游序列，使用Primer 3.0設計ET-1基因兩個SNPs位點的單堿基延伸引物。延伸引物序列：rs5370SF TTTTATCCCAAGCTGAAAGGCAA，rs1800541SR TTTTTTTTTTTTTGA ATTTTTGTTTGTTCTCCACCA。延伸反應條件：96℃預變性1 min；96℃變性 10 s，50℃退火 5 s，60 ℃延伸 30 s，28個循環；60℃延伸1 min。延伸產物純化：在10 μL延伸產物中加入1 U SAP酶，37℃溫浴 1 h，然后75℃滅活15 min。純化后的延伸產物在ABI 3130XL測序儀上樣。收集ABI 3130XL測序儀上的原始數據，用GeneMapper 4.0進行SNP信息分析。選取有代表性的樣本對每種基因型測序，在SNP數據庫中對測序結果進行比較分析。

1.5 統計學方法采用SPSS 16.0進行統計，按Hardy-Weinberg平衡法檢驗群體代表性。對腦出血與正常對照組兩組間基因型和等位基因的頻率比較采用χ2檢驗，血壓水平和不同基因型亞組間血壓比較采用t檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 一般情況共納入腦出血患者195例，男133例，女62

例，平均(55.40±11.21)歲；對照組 116例，男 41例，女 75例，平均(54.97±10.41)歲。兩組在年齡、性別、體重指數、吸煙史方面差異無統計學意義。腦出血組冠心病史、高血壓病史和糖尿病史均高于對照組（P＜0.05）。血壓水平比較，腦出血組的平均動脈壓顯著高于對照組（P＜0.05）。血脂水平比較，腦出血組甘油三脂和高密度脂蛋白膽固醇水平（HDL-C）顯著低于對照組（P＜0.05）。

2.2ET-1基因rs5370、rs1800541多態分布116例健康對照中，成功分型出114例，陽性檢出率＞95%。各SNPs的基因型及等位基因頻率分布符合Hardy-Weinberg平衡。研究發現長沙地區漢族人群中，ET-1基因rs5370多態有GG、GT、TT三種基因型，ET-1基因rs1800541多態有 TT、TG、GG三種基因型。選取具代表性樣本進行直接測序，各位點基因型全部與測序結果吻合見（圖1）。通過查詢http：//www．ncbi．nlm．nih．gov/中 dbSNP， 我們ET-1基因rs5370、rs1800541多態的基因型及等位基因頻率及與其他人群比較結果見表 1、2，差異均無統計學意義（P＞0.05）。

2.3ET-1基因rs5370、rs1800541多態與腦出血的關系本研究195例腦出血患者中，成功分型出194例，陽性檢出率＞95%。腦出血組與對照組的ET-1基因rs5370、rs1800541多態基因型及等位基因頻率比較見表3。腦出血組與對照組ET-1基因rs5370、rs1800541基因型及等位基因頻率比較差異均無統計學意義（P＞0.05）。ET-1基因rs5370、rs1800541多態性與腦出血的易感性之間無明顯相關性。

2.4ET-1基因rs5370、rs1800541多態對血壓的影響腦出血組與對照組ET-1基因rs5370、rs1800541多態不同基因型對收縮壓 (systolic blood pressure,SBP)、舒張壓(diastolic blood pressure,DBP)和平均動脈壓(mean arterial pressure,MAP)的影響見表4。腦出血組及對照組ET-1基因rs5370、rs1800541多態各基因型亞組間 SBP、DBP和 MAP水平均無統計學差異(P＞0.05)。

3 討論

內皮素-1（endothelin-1,ET-1）是內皮素家族的主要成員，也是人體內內皮素的主要存在形式，主要由血管內皮細胞分泌[8]，能通過長程收縮血管導致血壓升高，現已被認為是高血壓的一個重要危險因素[6]。高血壓是腦出血的主要病因。趙永波等[9]發現ET-1可能為高血壓及高血壓性腦出血的共同危險因素，并參與、影響高血壓性腦出血的病理生理過程。武婕等[10]研究表明血漿ET水平的升高程度與腦出血量有一定關系。ET-1的血漿水平及其生物學活性均主要由ET-1基因調控[6]。

表1正常對照人群中rs5370多態分布及其他人群比較

圖1 ET-1基因rs5370、rs1800541多態基因分型結果與測序圖。A～C為 ET-1基因rs5370多態位點的基因分型結果，分別代表GG、TT、GT基因型；D～F為 ET-1基因 rs1800541多態位點的基因分型結果，分別代表 TT、GG、TG基因型；G～I為 ET-1基因rs5370多態位點正向測序圖，分別代表GG、GT、TT基因型；J～L為 ET-1基因rs1800541多態位點反向測序圖，分別代表TT、TG、GG基因型

表2正常對照人群中rs1800541多態分布及其他人群比較

表4 腦出血組與對照組ET-1基因rs5370、rs1800541多態對血壓的影響

ET-1基因rs5370多態一直是ET-1基因與疾病研究的主要目標多態位點[11]。既往研究表明，ET-1基因rs5370等多態與普通人群高血壓病無關，僅與某些特殊人群（如肥胖患者、孕婦等）中的高血壓相相關[12-14]。有關rs5370與腦出血的相關性尚未見報導。PANOULAS等[15]發現ET-1基因rs1800541與rs5370多態構成的單倍體（T-T）與風濕性關節炎患者ET-1血漿水平增高及其罹患高血壓 （舒張壓升高為主）的風險增高有關。因此，我們的研究特意選擇了ET-1基因rs5370多態及與rs5370多態在同一染色體上并位置鄰近的ET-1基因rs1800541多態作為候選位點。研究結果顯示長沙地區漢族人群中，腦出血ET-1基因rs5370、rs1800541多態基因型及等位基因頻率分布與對照組比較均無顯著性差異，提示ET-1基因rs5370、rs1800541多態可能與腦出血的發病無關。我們加做了其單體型與腦出血的關系研究，但仍未得到陽性發現。

本研究顯示對照組ET-1基因rs5370、rs1800541多態基因型亞組間的血壓水平無統計學差異（P＞0.05），與既往研究結果相符。本研究顯示腦出血組的平均動脈壓顯著高于對照組 （P＜0.05），但腦出血組ET-1基因rs5370、rs1800541多態基因型亞組間的血壓水平無顯著性差異（P＞0.05）， 提示ET-1基因 rs5370、rs1800541 多態可能不是影響腦出血患者血壓水平的重要因素。

綜上所述，在長沙漢族人群中，采用病例-對照法對ET-1基因rs5370、rs1800541多態與腦出血的關系進行研究，結果提示ET-1基因rs5370、rs1800541單核苷酸多態可能與腦出血的發病無關，并可能不是影響其血壓水平的重要因素。但腦出血是一種多基因復雜性狀疾病，其遺傳模式復雜、未知，加上遺傳異質性、表型異質性及各種環境因素的影響，仍須在不同種族、地域人群中進行更大樣本量的研究，以進一步明確ET-1基因rs5370、rs1800541多態與腦出血的關系。