茶葉中甲萘威農殘表面增強拉曼光譜 (SERS)結合快速前處理檢測方法的建立

朱曉宇,艾施榮,彭雄鑫,李 紅,楊普香,李文金,陳 濤,吳瑞梅,*

(1.江西農業大學南昌市農產品加工與質量控制重點實驗室,江西南昌 330045; 2.江西農業大學工學院,江西南昌 330045; 3.江西農業大學理學院,江西南昌 330045; 4.江西省蠶桑茶葉研究所,江西南昌 330043)

茶葉是中國的主要經濟作物,而在茶葉種植過程中,存在農藥不合理使用及濫用等行為,導致茶葉中常被檢出農殘超標問題。甲萘威(又名西維因),是一種常用于稻、茶、桑等作物的氨基甲酸酯類農藥,因具有高效、低毒等特點,而被廣泛使用于農產品中病蟲害防治。但其具有觸殺、胃毒作用,會損害人體免疫系統和神經中樞系統,人長期食用甲萘威超標農產品,易導致致癌等癥狀。因此,我國制定了嚴格的甲萘威農殘限量標準。近年來,甲萘威農藥殘留檢測方法有高效液相色譜法[1-2]、生物傳感器法[3-4]、酶抑制法[5]、酶聯免疫法[6]等。這些方法用于檢測農藥的殘留,但存在前處理復雜、儀器昂貴、耗時長等缺點。

表面增強拉曼光譜(Surface-enhanced Raman Spectroscopy,SERS)技術利用金、銀等金屬粗糙表面產生電磁場作用,可將吸附在金屬粗糙表面的待測物拉曼信號增強106～109倍,從而提高檢測靈敏度[7-8]。SERS技術具有樣品制備簡單、檢測速度快、檢測靈敏度高等優點,廣泛用于食品農產品痕量農藥殘留[9-10]、獸藥殘留[11]等危害物質的快速檢測。胡琪等[12]采用SERS技術對水溶液中甲萘威殘留進行分析,其檢測結果可達0.1 mg/L,滿足國家標準。Liu等[13]利用SERS對水果中甲萘威、亞胺硫磷、谷硫磷進行檢測,其檢測濃度均低于6.66 ppm。農產品基質復雜,對SERS方法的檢測精度影響很大。陳漾等[14]應用SERS技術檢測椰汁中西維因農藥殘留,通過對西維因進行偶合反應,最低檢出濃度達到1.7 mg/L,間接建立椰汁中西維因的分析方法,但上述方法需重氮偶合反應前處理,操作過程復雜、耗時長、成本高。

茶葉是一種常見的保健飲品,其成分復雜,對農藥分子檢測基質效應大,因此,有效的樣品前處理是分析方法的關鍵。本文研究不同凈化劑去除茶葉基質效應的影響,尋找一種快速、簡單、高效的茶葉農藥殘留SERS檢測的快速前處理方法,以提高方法檢測精度,降低方法的檢測限,建立茶葉中甲萘威農藥殘留的SERS快速檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甲萘威標準品(99.0%) 美國Sigma公司;氯金酸AuCl3·HCl·4H2O(99.7%) 上海國藥集團化學試劑有限公司;乙腈、無水硫酸鎂、氯化鈉 分析純,國藥集團化學試劑有限公司,有機濾膜0.22 μm 美國Agilent公司;檸檬酸三鈉 分析純,西隴化工股份有限公司;N-丙基乙二胺(PSA) 天津博納艾杰爾科技有限公司;納米竹炭(NBC) 上海海諾炭業有限公司;陰性茶葉樣本(農藥殘留均在國家標準以內) 由江西出入境檢驗檢疫局提供。

RamTracer-200-HS高靈敏度激光拉曼光譜儀 Opto Trace Technologies,Inc.;JW-1024離心機 安徽嘉文儀器裝備有限公司;ZNCL-T智能恒溫磁力攪拌器 鄭州市亞榮儀器有限公司;VORTEX-5渦旋混合器 海門市其林貝爾儀器有限公司;FA2004電子天平 上海舜宇恒平科學儀器有限公司;Hitachi S-4800掃描電子顯微鏡 日本Hitachi公司;T6紫外可見分光光度計 北京浦西通用儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 金納米增強基底的制備及表征 采用經典檸檬酸鈉還原HAuCl4方法,制備金納米增強基底[15]。具體制備過程如下:將100 mL濃度為1 mmol/L的氯金酸溶液移入到100 mL圓底燒瓶中,加熱至沸騰;將3.7 mL質量濃度為1%的檸檬酸鈉溶液,迅速加入到沸騰的氯金酸溶液中,繼續加熱并劇烈攪拌20 min,得到紅棕色懸浮液,自然冷卻到室溫,置于-4 ℃環境下保存,備用。

取一定量的金納米溶膠,用超純水將其稀釋后,用紫外分光光計測定稀釋液的吸光度,單次掃描,掃描波長范圍400～900 nm,間隔2 nm。取一定量的金納米溶膠進行離心清洗,去除上清液,離心步驟重復2次,將濃縮的納米金顆粒滴加于干凈的硅片上,干燥后于掃描電子顯微鏡下觀察。SEM工作電壓為10 kV,電流為10 μA,工作距離為6.7 mm,放大倍數為100 k。

1.2.2 以茶葉提取液為基質甲萘威溶液的配制 稱取甲萘威固體標準品1.05 g,轉移至100 mL容量瓶中,用少量乙腈超聲溶解后,定容至100 mL刻度線,得到105 mg/L的甲萘威標準儲備液,用乙腈將標準儲備液稀釋成濃度梯度:100、90、65、55、40、25、20、15、10、5 mg/L。

稱取2.00 g綠茶陰性樣本于50 mL的離心管中,加入10 mL乙腈,渦旋2 min,4500 r/min離心5 min。取0.3 mL的甲萘威標準品和2.7 mL茶葉上清液混合,按照1∶9(甲萘威農藥標準品∶茶葉上清液)用茶葉上清液將甲萘威標準溶液稀釋成不同濃度梯度的含農藥殘留茶葉溶液:5.56、5.00、3.61、3.06、2.22、1.39、1.11、0.83、0.56、0.28 mg/kg。

1.2.3 拉曼光譜采集 分別取500 μL金膠、40 μL待測溶液、100 μL 1%氯化鈉溶液加入到石英進樣瓶中,混合均勻,采集拉曼信號。激發波長:785 nm,激光功率:400 mW,積分時間:10 s,積分次數:2次,分辨率:4 cm-1。每個樣本采集3次,求平均值。

1.2.4 甲萘威拉曼光譜理論計算 采用GaussView 4.1 軟件模擬構建甲萘威分子結構,并用Gaussian 03W優化計算拉曼譜峰,計算方法為B3LYP,計算基組6-31G,由GaussView 4.1分析計算結果,得到甲萘威理論計算拉曼譜圖。

1.2.5 茶葉提取液基質優化 茶葉中樣品前處理是影響分析農殘檢測的關鍵,通過對比PSA和NBC填料及用量對茶葉基質的凈化效果,優選出最佳填料及用量,以提高方法的檢測精度和靈敏度。

1.2.5.1 PSA填料用量優化 分別稱取0、50、100、150、200、250 mg PSA填料于6個10 mL離心管中,分別加入200 mg無水硫酸鎂;取2 mL含甲萘威農藥殘留的茶葉提取液,分別加入上述離心管中,渦旋2 min后,于轉速4500 r/min離心5 min,取上清液,過0.22 μm有機濾膜,上機檢測,分析PSA的凈化效果及其最優用量。

1.2.5.2 NBC填料用量優化 分別稱取0、15、20、25、30、35、40 mg NBC于7個10 mL離心管中,分別加入200 mg無水硫酸鎂;取2 mL含甲萘威農藥殘留的茶葉提取液,分別加入上述離心管中,渦旋2 min后,于轉速4500 r/min離心5 min,取上清液,過0.22 μm有機濾膜,上機檢測,分析NBC的凈化效果及其最優用量。

1.2.6 標準曲線的繪制 按照1.2.5的前處理方法,1.2.3的操作步驟采集以茶葉提取液為基質配制不同濃度甲萘威溶液(1.2.2)信號,以拉曼特征峰強度為縱坐標(Y),甲萘威濃度為橫坐標(X),繪制標準曲線。

1.2.7 回收率實驗測定 按1.2.2中配方法得到2.5、4.17、5.28 mg/kg 3個濃度的待測溶液,每個濃度配制3個平行樣本,按照1.2.3實驗條件測定拉曼特征峰強度,計算回收率和相對標準偏差(RSD)。

1.3 數據處理

使用OriginPro-2016 9.0和MATLAB R2014a對實驗數據進行分析。

2 結果與討論

2.1 金納米溶膠表征

圖1是金溶膠紫外吸收光譜圖(a)和電鏡掃面圖(b)。從圖1可看出,金溶膠最大吸收峰為540 nm,該吸收峰呈單峰,表明試驗所制備的金納米粒子呈球形,且粒徑均勻,粒徑約為55 nm[16]。采用電鏡掃描圖可進一步對金納米粒子進行表征,由圖(b)可以看出,金納米粒子呈球形,粒徑約為55 nm,分散效果良好。

圖1 金納米溶膠的UV-Vis圖(a)和SEM圖(b)Fig.1 UV-Vis spectrum(a) and SEM(b)spectrum of gold colloids

2.2 甲萘威標準溶液的普通拉曼光譜與SERS光譜分析

圖2(a)、(b)、(c)和(d)分別是濃度為2 mg/L甲萘威標準溶液的SERS、普通拉曼光譜、乙腈的SERS和金納米膠體拉曼譜圖。從圖2(d)中可看出,金溶膠中未出現拉曼峰,說明增強基底不會對試驗產生干擾。由圖2(b)和(c)可看出,甲萘威普通拉曼光譜與乙腈SERS譜圖基本相似,說明甲萘威普通拉曼譜圖中農藥分子特征峰未得到增強;而圖2(a)具有明顯的拉曼譜峰,說明所制備的金納米膠體對甲萘威分子增強效應顯著。

圖2 2 mg/L甲萘威標準溶液的SERS(a)和普通拉曼光譜(b)、乙腈的SERS(c)、金納米膠體的光譜(d)Fig.2 SERS(a)and ordinary Raman spectroscopy(b)of 2 mg/L carbaryl standard solution,SERS of acetonitrile(c) and Raman spectrum of gold nanocolloid(d)

2.3 茶葉中甲萘威分子特征譜峰的確定

2.3.1 甲萘威分子的理論計算譜峰與試驗譜峰分析 圖3(a)是濃度為10 mg/L甲萘威標準溶液的SERS,(b)是甲萘威分子的理論計算拉曼光譜。從圖3可看出,在1211 cm-1處,試驗譜峰與理論計算譜峰完全一致,而923、1106、1487、1528、1557 cm-1處試驗譜峰與理論計算譜峰略有偏移。在768、1039、1349、1409 cm-1處存在理論計算譜峰,而試驗譜峰中未出現,在806、1003、1057、1426 cm-1處,試驗譜峰出現而理論譜峰未出現。這是因為,甲萘威分子與溶劑分子之間存在相互作用力,導致增強基底對不同官能團產生的增強效果差異較大,從而使試驗拉曼譜峰出現偏移現象,而理論模擬譜峰是在理想狀態下對單個分子進行模擬仿真計算,未考慮分子間作用力影響,從而出現有些試驗譜峰與理論計算譜峰略有偏移,有些譜峰在理論計算和試驗中不會同時出現[17]。

圖3 濃度為10 mg/L甲萘威標準溶液的SERS(a)和甲萘威的理論計算譜峰(b)Fig.3 SERS for 10 mg/L carbaryl standard solution(a) and the theoretical Raman spectrum of carbarly(b)

表1 甲萘威的拉曼譜峰歸屬Table 1 Assignment of Raman peaks of carbaryl

甲萘威分子結構中含有萘環、-C-O-、-C-H-、-C-N-、-C=C-、-N-H-等官能團,不同官能團對應的拉曼振動譜峰不同,對甲萘威分子進行譜峰歸屬[13]。表1是甲萘威理論拉曼譜峰與試驗譜峰歸屬結果,其中1557、923、1106、1211、1487、1528 cm-1的理論計算譜峰和試驗譜峰基本相吻合,對這些譜峰進行歸屬,1557 cm-1處峰強最高,歸屬于萘環上-C=C-的伸縮振動,923 cm-1歸屬于萘環的變形振動,1106 cm-1歸屬于C10H7O-C-上-C-O-的伸縮振動,1211 cm-1主要歸屬于CH3-NH-上-C-N-的伸縮振動,1487 cm-1歸屬于氨基上-N-H-的伸縮振動,1528 cm-1歸屬甲基上-C-H-的搖擺振動。上述振動譜峰可作為甲萘威分子的特征峰。

2.3.2 茶葉中甲萘威農藥譜峰分析 圖4(a)是濃度為10 mg/L甲萘威標準溶液的SERS,(b)是陰性茶葉提取液SERS,(c)是濃度為10 mg/L含農殘茶葉提取液的SERS,(d)是乙腈的SERS。從標準溶液譜圖4(a)及表1可知,923、1106、1211、1487、1528、1557 cm-1是甲萘威農藥分子的特征譜峰;4(b)圖中陰性茶葉基質的SERS譜圖中有大量譜峰,但并未出現甲萘威分子的特征譜峰;含農殘茶葉提取液SERS的譜圖4(c)也有大量譜峰。對比圖4(b)、4(c)和4(d)及表1可知,含農殘茶葉提取液SERS的譜圖中出現了3個甲萘威分子特征譜峰:1103、1213、1557 cm-1,這些特征譜峰與茶葉成分的譜峰并不重疊。由此得出,1103、1213、1557 cm-1這3個特征峰可用于定性定量分析茶葉中甲萘威農藥殘留。

圖4 10 mg/L甲萘威標準溶液SERS(a)、陰性茶葉提取液SERS(b)、濃度為10 mg/L以茶葉 提取液為基質的甲萘威SERS(c)、乙腈的SERS(d)Fig.4 SERS for 10 mg/L carbaryl standard solution(a), SERS of negative matrix of tea extraction(b)and SERS of 10 mg/L carbarly solution based on tea extraction(c),SERS of acetonitrile(d)

2.4 茶葉提取液凈化優化結果分析

2.4.1 PSA優化結果分析 圖5是不同PSA用量對茶葉中色素的凈化效果圖(A)和SERS(B)。從圖5(A)中可以看出,隨著PSA用量增加,茶葉上清液顏色無明顯變化,說明PSA對綠茶基質中的色素吸附作用較差,不能消除基質干擾。在拉曼譜圖(B)中也沒有出現甲萘威的特征峰,說明茶葉中甲萘威農藥分子的拉曼譜峰受到茶葉基質效應的干攏,PSA凈化劑并不能消除茶葉的基質效應。

圖5 不同用量PSA對茶葉提取液基質效應的凈化處理效果圖(a)和SERS光譜(b)Fig.5 Purification effect(a)and SERS spectra(b)of tea extraction treated by different dosage of PSA

2.4.2 NBC優化結果分析 圖6是不同NBC用量對茶葉中色素凈化效果圖(a)和SERS(b)。由凈化效果圖(a)可看出,當NBC用量為15 mg時,能消除大量色素,但凈化液中還能見到少量顏色;當用量為20 mg時,凈化液無色透明,說明NBC凈化劑能吸附茶葉中的色素,以去除茶葉中色素的熒光效應。當NBC用量為20～25 mg時,SERS圖(b)未出現甲萘威的特征峰,而當NBC用量為30 mg時,出現了甲萘威的1103、1213、1557 cm-1特征峰(圖中為1106、1215、1557 cm-1),說明30 mg NBC的用量能消除茶葉成分對農藥分子的基質效應。當NBC用量繼續增加為35、40 mg時,拉曼譜圖相較于NBC為30 mg時,甲萘威特征峰無明顯變化。因此,本研究采用30 mg NBC的用量用于消除茶葉的基質效應。

圖6 不同用量NBC對茶葉提取液基質效應的凈化處理效果圖(a)及SERS光譜(b)Fig.6 Purification effect(a)and SERS spectra(b)of tea extraction treated by different dosage of NBC

2.5 茶葉中甲萘威農藥殘留分析

圖7是含甲萘威農藥殘留的茶葉提取液SERS,從圖7可知,當甲萘威濃度降低時,其特征峰強度也隨之減弱,濃度為3.61 mg/kg時,1103、1213 cm-1處譜峰已無法識別,而1557 cm-1處譜峰信號清晰可見;濃度為0.83 mg/kg時,1557 cm-1處譜峰仍可辨出,而濃度為0.56 mg/kg時,未見該特征譜峰,說明本方法檢測茶葉中甲萘威農藥的最低檢出濃度可達到0.83 mg/kg,符合我國規定甲萘威農藥殘留最大限量標準的檢測限1 mg/kg,單個樣本檢測可在10 min內完成。

由圖7可知,1557 cm-1特征峰強度最強,且峰型好,故選用1557 cm-1處的峰強度與茶葉中甲萘威濃度建立標準曲線,在濃度0.28～5.56 mg/kg范圍內,建立的相關曲線為y=0.1036x+1.8642,決定系數R2=0.9744。圖8是以1557 cm-1特征峰強度制作的標準曲線圖,由圖8可知,1557 cm-1特征峰強度與茶葉中甲萘威濃度呈現良好的線性關系。

圖7 甲萘威農藥殘留的茶葉提取液SERS光譜Fig.7 SERS spectra of tea extracts containing carbaryl pesticide residues 注:a～j:5.56、5.00、3.61、3.06、2.22、 1.39、1.11、0.83、0.56、0.28 mg/kg。

圖8 以茶葉提取液為基質的甲萘威溶液曲線Fig.8 Standard curve of carbaryl solution based on tea extraction

2.6 方法準確度與精密度分析

向陰性茶葉提取液中加入甲萘威農藥標準溶液,配制2.5、4.17、5.28 mg/kg 3個濃度梯度的待測液,每個濃度測定3個平行樣本,得到方法的回收率和相對標準偏差,以檢驗方法的準確度和精密度,結果見表2。方法平均回收率在76.5%～94.9%之間,相對標準偏差(RSD)為3.87%～6.98%,說明本方法用于分析茶葉中甲萘威農藥殘留是準確可靠的。

表2 茶葉中甲萘威的平均回收率和相對標準偏差Table 2 Average recovery and relative standard deviation of carbaryl in tea

3 結論

本文研究茶葉中甲萘威農藥殘留的表面增強拉曼光譜快速檢測方法。采用金溶膠為增強基底,對比分析PSA和NBC填料及其用量對檢測結果的影響,發現PSA對茶葉基質的凈化效果較差,而NBC凈化效果明顯,并得出NBC填料的最優用量為30 mg。結合密度泛函理論,確定了定性定量分析茶葉中甲萘威農藥殘留的3個拉曼特征峰:1103、1213、1557 cm-1。在濃度0.28～5.56 mg/kg范圍內,以1557 cm-1處峰強度建立了茶葉中甲萘威農藥殘留的定量分析曲線:y=0.1036x+1.8642,決定系數R2=0.9744。此方法平均回收率在76.5%～94.9%之間,相對標準偏差(RSD)為3.87%～6.98%結果表明該方法的準確度和精密度較好。該方法分析茶葉中甲萘威農藥殘留的最低檢出濃度為0.83 mg/kg,達到我國規定甲萘威農藥殘留最大限量標準的檢測限(1 mg/kg)。本方法前處理簡單、單個樣本檢測在10 min內完成,而采用高效液相色譜法約需30 min,且檢測成本高[18]。該研究可為茶葉中農藥殘留快速檢測裝置開發提供方法支持。