人參皂苷Rg1對LRRK2突變致帕金森病果蠅的治療作用探討

趙文學，趙雨，王偉楠，鄭麗娜，劉美辰

（長春中醫藥大學吉林省人參科學研究院，吉林長春130117）

帕金森?。╬arkinson's disease，PD）是常見晚發型神經退行性疾病，是進行性發展的致死性復雜疾病。PD 的發病誘因大多為散發性，只有約5%～10%的人群為家族遺傳性[1]。雖然只有少數人群的發病誘因為家族遺傳性，但描述這些致病基因的致病機理，為深入了解PD 的發病機制及藥物靶點的發現提供了新的研究思路。

LRRK2 是較為常見的常染色體顯性遺傳PD 相關基因，LRRK2 突變是構成家族性和散發性PD 的最常見已知原因[2-4]。LRRK2 基因在受黑質（substantia nigra，SN）影響的多巴胺神經元中呈現極低的表達量，而在接受黑質多巴胺（dopamine，DA）輸入的紋狀體神經元中則出現更高的表達[5-6]。LRRK2 是一種具有激酶和GTP 酶結構域的大型多域蛋白，其激酶功能域與MAPK 蛋白激酶功能相近，其活性的升高是較為公認的PD 致病機制之一，更是臨床PD 治療藥物開發的主要設計靶點[7]。已有研究表明，MAPK 傳導途徑中有3種蛋白與PD 的發生發展相關，分別為ERK、P38 MAPK 以及 JNK[8]。LRRK2 能夠激活 P38 MAPK 進而調控JNK 信號傳遞途徑，引起細胞凋亡[9]。此外，氧化應激所產生的活性氧（reactive oxygen species，ROS）亦是引起凋亡的另一個關鍵因素。但當ROS 產生量上升時，機體可誘導產生保護性蛋白，進而起到保護細胞免受凋亡的作用。其中的Keap1/Nrf2/ARE 信號傳遞途徑是機體抗氧化機制中最為重要的信號傳遞途徑[10]。當機體發生氧化應激反應時，Nrf2（NF-E2-related factor 2）與 Keap1（Kelch-like ECH-associated protein-1）親和能力降低，呈現游離狀態轉入細胞核內，與ARE結合，啟動GCLC 等關鍵抗氧化蛋白的轉錄表達，誘導細胞自身抗氧化能力增強，維護內環境穩態，保護細胞免受氧化應激的損傷[11]。

人參皂苷是人參中的主要活性成分，人參皂苷Rg1 對于PD 模型的作用效應已取得了比較多的研究進展。人參皂苷 Rg1 對于 1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-terahydropyridine，MPTP）及魚藤酮等神經毒性物質誘導的神經元細胞凋亡具有顯著保護作用，其作用途徑可能是通過降低活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平以及線粒體細胞色素C 向細胞質的釋放，進而抑制caspase-3活力，減少凋亡實現的[12]。同時，人參皂苷Rg1 在磷酸化胞外調節激酶1/2（phospho extracellular regulated protein kinases，P-ERK1/2）信號通路依賴的神經保護作用中亦發揮了協同作用[13-15]。人參皂苷Rg1 預處理，可見磷酸化P-38，COX-2 和PGE2 陽性細胞顯著減少，并且改善了TH（+）神經元的顯著減少現象，這意味著Rg1 可能通過作用于P-38 信號通路以保護PD中的多巴胺能神經元[16]。以上研究結果證明了人參皂苷Rg1 對于PD 的潛在治療效應。因此，本實驗選用LRRK2 突變轉基因果蠅品系，于體內整體水平驗證人參皂苷Rg1 對于果蠅PD 模型的保護作用，驗證其對LRRK2 激酶活性的抑制作用效應，并通過進一步的實驗驗證其作用途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人參皂苷Rg1：長春中醫藥大學生物工程實驗室；辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記羊抗鼠二抗Ig G、HRP 標記羊抗兔二抗Ig G：英國英杰生命技術有限公司；抗體P-LRRK2、P-P38MAPK、ERK、P-ERK：艾博抗（上海）貿易有限公司；抗體兔抗Nrf2多抗、兔抗谷氨酰半胱氨酸合成酶（glutamate-cysteine ligase catalytic，GCLC）多抗：上海斯信生物科技有限公司；抗體Flag：上海欣百諾生物科技有限公司；37%多聚甲醛、TritonX-100：美國西格瑪奧德里奇公司；二氫乙啶：威格拉斯生物技術（北京）有限公司；動物非免疫血清（羊）：福州邁新生物技術開發有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器

SZ660 系列連續變倍體式顯微鏡：重慶奧特光學儀器有限公司；MJX-430 果蠅培養箱：浙江托普儀器有限公司；DHG-9070A 型電熱恒溫鼓風干燥箱：上海精宏實驗設備有限公司；PL203 型天平：Mettler TOLEDD；SX-700 滅菌鍋：上海博訊實業有限醫療設備廠；WPUP-YJ-40 超純水儀：沃特浦；DFPCO2LID 型 CO2麻醉板：上海玉博生物科技有限公司；BT01-100 型恒流泵：上海滬西分析儀器廠有限公司；S210 型pH 計：梅特勒-托利多；1645050 型電泳儀：伯樂生命醫學產品（上海）有限公司；FL1000 成像系統：上海哈靈生物技術有限公司；501985 型解剖鑷子：世界精密儀器商貿（上海）有限公司。

1.3 果蠅品系

實驗所用品系 TH-GAL4；UAS-LRRK2 1915T 以及MHC-GAL4；UAS-LRRK2 1915T 由長春中醫藥大學生物工程實驗室構建。

1.4 方法

1.4.1 果蠅培養基的制備

稱取玉米粉175 g，黃豆粉30 g 及瓊脂粉20 g，加入3 L 純凈水充分攪拌溶解。保持沸騰狀態30 min 后加入60 g 安琪酵母粉，50 g 蔗糖，50 g 葡萄糖，充分混勻后繼續加熱煮沸。隨后量取90mL甘蔗糖漿加入容器中，冷卻20 min 加入10%尼泊金甲酯40mL及丙酸20mL制成普通培養基。在普通培養基的基礎上，配成Rg1 終濃度為 0.1、0.4 mmol/L 和 1.6 mmol/L 的含藥培養基。

1.4.2 藥物分組

將LRRK2 1915T 突變果蠅分為4 個不同作用濃度組（0、0.1、0.4、1.6 mmol/L），并設置于幼蟲期和成蟲期均給藥（L+/A+）和僅有成蟲期給藥（L-/A+）兩種藥物作用方式。利用果蠅壽命實驗確定給藥方式和最佳藥物作用濃度以用于后續果蠅爬行能力分析、腦部多巴胺含量分析和Western blot 檢測。

1.4.3 果蠅壽命實驗

收取各組8 h 內新羽化未交配的雄蠅成蟲100只，每管分裝20 只果蠅到含藥培養基中，于29 ℃培養箱中培養。之后每24 h 于同一時刻觀察記錄各模型各喂藥組果蠅生存情況，直至受試果蠅全部死亡，期間每隔1 d 更換一次新的培養基，以防因食物黏連造成死亡。

1.4.4 果蠅爬行能力檢測

果蠅的負趨地性用來分析果蠅的爬行能力。取各生長時間點（I：3日齡～6日齡；II：10日齡～15日齡；III：20日齡～25日齡）實驗組和對照組果蠅，經 CO2麻醉后，各隨機抽取30 只放于長10 cm，直徑約為1.5 cm的塑料長管中。室溫（25 ℃）放置20 min 以確保果蠅于麻醉狀態中蘇醒，且充分適應環境。設置終點距離為距離管底6 cm 處。隨后，輕柔將爬行管中的果蠅敲至管底，記錄10 s 內到達終點處的果蠅數，每組實驗重復10 次。

1.4.5 果蠅腦部多巴胺含量檢測

取各病理模型組及對照組2日齡雄蠅100 只，按照每培養管20 只隨機分為對照組和藥物組。藥物濃度設置為單一藥物濃度，選擇依據為果蠅壽命實驗篩選出的有效藥物濃度。受試果蠅轉管至含藥培養基，并置于29 ℃培養箱中實驗即為正式開始，于疾病發展的 3 個不同時期（I：3 d～5 d；II：15 d～18 d；III：25 d～30 d）在培養的100 只果蠅中隨機選取3 只，剪取果蠅大腦進行多巴胺含量檢測，每組設置5 個平行對照。

1.4.6 Western blot 檢測

收取各實驗組10日齡～15日齡果蠅30 只，冰上剪取果蠅頭部，提取蛋白質，檢測給藥前后果蠅腦中P-LRRK2、Nrf2、谷氨酰半胱氨酸合成酶（glutamate--cysteine ligase catalytic，GCLC）、細胞外調節蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）、P -P38MAPK 的表達變化。

1.4.7 統計學分析

除特殊說明外，所有研究均進行至少3 次的生物學重復，數據以means±SD 形式展示。統計學分析應用GraphPad Prism6 軟件完成，組間差異分析應用Oneway ANOVA 分析方法完成。

2 結果與分析

2.1 人參皂苷Rg1對LRRK2-1915T果蠅存活率的影響

人參皂苷Rg1 對LRRK2-1915T 果蠅存活率的影響見圖1。

圖1 人參皂苷Rg1 對LRRK2-1915T 果蠅存活率的影響Fig.1 Effect of ginsenoside Rg1 on the survival rate of LRRK2-1915T fruit fly

相對于對照組TH-GAL4 果蠅，LRRK-1915T 突變果蠅的存活率顯著降低（P＜0.05）。以0.4 mmol/L 人參皂苷Rg1 于幼蟲發育期和成蟲發育期同時喂食病理模型果蠅時，可在一定程度上提高病理模型果蠅的存活率。同樣作用濃度下如幼蟲期不給藥，則作用效應消失。以0.1 mmol/L 和0.6 mmol/L 人參皂苷Rg1 喂食病理模型果蠅時，則無顯著作用效應。

2.2 人參皂苷Rg1對LRRK2-1915T果蠅爬行能力的影響

人參皂苷Rg1 對LRRK2-1915T 果蠅爬行能力的影響見圖2。

圖2 人參皂苷Rg1 對LRRK2-1915T 果蠅爬行能力的影響Fig.2 Effect of ginsenoside Rg1 on the crawling ability of LRRK2-1915T fruit fly

由圖2 可知，對照組果蠅MHC-GAL4 的爬行能力隨著培養時間的延長出現了一定程度的降低，但LRRK-1915T 病理模型組爬行能力降低的更為顯著。而在疾病發展的I（3 d～5 d）和II（15 d～18 d）期，人參皂苷Rg1 0.4 mmol/L 能在一定程度上挽救1915T 果蠅爬行能力的降低，但當疾病進展至 III（25 d～30 d）期時，藥物作用效應消失。

2.3 人參皂苷Rg1對LRRK2-1915T果蠅腦多巴胺（DA）含量的影響

人參皂苷Rg1 對TH＞dLRRK2-1915T 果蠅腦DA含量的影響見圖3。

圖3 人參皂苷Rg1 對LRRK2-1915T 果蠅腦部多巴胺含量的影響Fig.3 Effect of ginsenoside Rg1 on dopamine content in LRRK2-1915T drosophila brain

由圖3 可見 I（3 d～5 d）、II（15 d～18 d） 以及 III（25 d～30 d）3 個不同時期中，對照組 TH-GAL4 果蠅隨生長時間的延長DA 含量也出現了一定程度的下降，但病理模型組DA 下降更為顯著，0.4 mmol/L 人參皂苷Rg1 均可在一定程度上挽救LRRK2 突變導致的DA 含量降低。以上研究結果充分說明于果蠅幼蟲發育和成蟲發育時期同時給與0.4 mmol/L 人參皂苷Rg1干預，可以挽救LRRK2 突變導致的果蠅PD 樣病理表型。

2.4 人參皂苷Rg1對LRRK2-1915T果蠅保護作用機制探討

2.4.1 磷酸化LRRK2 表達量的改變

人參皂苷Rg1 對TH＞dLRRK2-1915T 果蠅磷酸化LRRL2 蛋白表達量的影響見圖4。

圖4 人參皂苷Rg1 對1915T 突變果蠅P-LRRK2 表達水平的影響Fig.4 Effect of ginsenoside Rg1 on the expression of P-LRRK2 in 1915T mutant Drosophila

由圖4 可知，與陰性對照組TH-GAL4 相比，LRRK2-1915T 突變果蠅磷酸化LRRK2 水平顯著升高（P＜0.000 1），給與 0.4 mmol/L 人參皂苷 Rg1 干預后，磷酸化 LRRK2 表達水平降低（P＜0.001）。

2.4.2 對Nrf2 和GCLC 表達的影響

人參皂苷Rg1 對 TH＞dLRRK2-1915T 果蠅 Nrf2和GCLC 蛋白表達量的影響見圖5。

圖5 人參皂苷Rg1 對1915T 突變果蠅Nrf2 和GCLC 表達水平的影響Fig.5 Effects of ginsenoside Rg1 on the expression of Nrf2 and GCLC in 1915T mutant Drosophila

由圖5 可知，與陰性對照組果蠅相比，LRRK-1915T 果蠅Nrf2 表達量顯著降低，而GCLC 無顯著變化，當給與人參皂苷Rg1 時，人參皂苷Rg1 可顯著提升Nrf2 和GCLC 蛋白的表達水平。

2.4.3 P-P38MAPK 表達的影響

人參皂苷Rg1 對TH＞dLRRK2-1915T 果蠅P-P38蛋白表達量的影響見圖6。

由圖6 可知，與陰性對照組果蠅相比，LRRK-1915T 果蠅磷酸化P38 水平顯著升高，而人參皂苷Rg1 可顯著抑制磷酸化P38 水平的上升趨勢。

2.4.4 磷酸化ERK 表達量的變化

人參皂苷Rg1 對TH＞dLRRK2-1915T 果蠅磷酸化ERKE 蛋白表達量的影響見圖7。

圖6 人參皂苷Rg1 對1915T 突變果蠅P-P38 表達水平的影響Fig.6 Effect of ginsenoside Rg1 on the expression of P-P38 in 1915T mutant drosophila

圖7 人參皂苷Rg1 對1915T 突變果蠅P-ERK 表達水平的影響Fig.7 Effect of ginsenoside Rg1 on the expression of P-ERK in 1915T mutant drosophila

由圖7 可知，與陰性對照組果蠅相比，LRRK-1915T 果蠅磷酸化ERK 水平顯著升高，而人參皂苷Rg1 可顯著抑制磷酸化ERK 水平的上升趨勢。

3 結論與討論

人參皂苷Rg1 對于PD 模型的作用效應已取得了比較多的研究進展。人參皂苷Rg1 對于MPTP 誘導的黑質神經元細胞凋亡顯示出保護作用，體內研究表明使用5.0、10.0 mg/kg 的Rg1 預處理，可增加體內Zona compacta 區 Nissl 染色和 TH（+） 神經元并且減少TUNEL（+）神經元（P ＜0.01）[17]。人參皂苷 Rg1 對于MPTP 誘導的SN 區神經元丟失現象的挽救也可能是通過其抗氧化效應實現的，同時抑制JNK 信號途徑的級聯反映。Rg1 可阻止GSH 的下降，保持SOD 活力，降低JNK 和c-Jun 的磷酸化程度[18]。關于人參皂苷Rg1的保護作用，在不同模型中的其他研究也提到Rg1 在磷酸化胞外調節激酶1/2（P-ERK1/2）信號通路作為神經保護中涉及的機制的重要性。CNS 中的抗炎活性被認為在PD 中發揮有益作用。在這一觀點的基礎上，發現人參皂苷Rg1 抑制體內MPTP 誘導的小鼠PD 模型SN 區 COX-2 表達；與 MPTP 模型組相比，用 Rg1 預處理磷酸化P-38，COX-2 和PGE2 陽性細胞顯著減少，并且改善了TH（+）神經元的顯著減少現象，意味著Rg1 可能通過作用于P-38 信號通路以保護PD 中的多巴胺能神經元[19]。

由此可見人參皂苷Rg1 對LRRK2 突變果蠅的挽救作用途徑可能是通過：1）激活Nrf2，從而升高了GCLC 蛋白的表達，產生了一定的抗氧化作用效用，提高神經元抵抗氧化應激的能力，進而保護了多巴胺能神經元的功能，維護DA 含量；2）抑制磷酸化P38 表達，阻斷JNK 信號傳遞途徑，一定程度抑制了LRRK2突變導致的LRRK2 激酶活性，進而維系了多巴胺能神經元功能。因此，本研究針對人參皂苷Rg1，利用果蠅活體器官模型，探討人參皂苷Rg1 對LRRK2 突變導致PD 樣病理癥狀的挽救作用，并從P38-JNK 信號途徑和氧化應激相關Keap1-Nrf2-ARE 信號途徑解釋了其作用機制。研究成果為人參皂苷Rg1 的神經保護作用提供了一定的科學依據。