正交試驗設計優化刺三加根中總多酚的提取工藝研究

高林曉，郭蒙，郭茂鴻，趙前程，吳偉，楊再波

（1．黔南民族師范學院化學化工學院，貴州都勻558000；2．貴州省普通高校民族藥用植物資源開發工程研究中心，貴州都勻558000）

刺三加[Acanthopanax trifoliatus（L.）Merr.]，屬于五加科五加屬攀援狀灌木，又名苦刺芽、刺三甲、白簕、三甲皮、雞腳菜、苦粉竻和苦刺芯等。其性平，辛微苦涼，氣微香，廣泛分布于我國中南部地區。刺三加根和皮作為藥物使用已經有悠久的歷史，特別在東南亞一帶，把刺三加根作為與人參同樣功效的藥物使用，具有祛風逐濕、散瘀止痛、舒筋活血、消腫解毒和止咳平喘等功效[1-3]。相關文獻對刺三加葉中化學成分、藥理作用和毒理活性等方面作了比較系統的歸納總結，其主要的有效化學成分包括皂苷類、黃酮類、揮發性成分、多糖類等[4-8]，但有關刺三加根中多酚的提取工藝優化和含量測定的研究鮮有報道。

研究表明植物多酚具有抗氧化、抑菌、抗腫瘤、降血脂、預防癌癥和清除自由基等功能[9-10]，其提取分離工藝研究越來越引起人們的重視。植物多酚傳統的提取方法有煎煮法、滲漉法、有機溶劑法以及回流提取法等，這些傳統的方法提取效率低、有效成分損失太多，存在雜質較多、影響藥效等缺點；現代提取方法有超聲輔助提取法、酶輔助提取法、微波輔助提取法以及超臨界流體萃取法等，與傳統提取方法相比，這些現代提取方法具有提取物純度高，操作簡單，收率高，節能等優點[11]。綜合考慮，本試驗選擇超聲輔助提取的方法。目前，針對總多酚各物質的結構特點而發展的含量測定方法主要有福林酚法[12-14]、高效液相色譜法[15-16]、高錳酸鉀滴定法[17]、酒石酸亞鐵分光光度法[18]和鐵氰化鉀分光光度法[19-20]等，由于比色法簡單、成本低、分析速度快，因此，本試驗選用酒石酸亞鐵法測定刺三加根中總多酚含量，并以總多酚的提取率為考察指標，采用正交試驗設計，優選出最佳提取工藝條件，為刺三加總多酚的合理利用和藥用部位的質量控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

刺三加根采自廣東恩平，經黔南民族師范學院生物科學與農學院黃小娜副教授鑒定為五加科五加屬植物刺三加根。采后于45 ℃烘干，粉碎過60 目篩，封口包裝。置閉光、陰涼處存放，待用。

沒食子酸對照品（純度≥98%，批號：BM170623）：合肥博美生物科技有限公司；酒石酸鉀鈉（分析純）、磷酸氫二鈉（分析純）：天津市致遠化學試有限公司；無水磷酸二氫鈉（分析純）：天津市化學試劑批發公司；硫酸亞鐵（分析純）：重慶茂業化學試劑有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

FW177 高速萬能粉碎機：天津市泰斯特儀器有限公司；DL-360D 智能超聲波清洗器：上海之信儀器有限公司；80-1 電動離心機：金壇市城東新瑞儀器廠；BS110S 電子天平：北京賽多利斯儀器系統有限公司；TU-1901 雙光束紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 刺三加根前處理及總多酚提取

準確稱取15.00 g 干燥、粉碎、過60 目篩后的刺三加根粉末，置于250mL錐形瓶中，室溫下，加150 mL石油醚對其進行浸泡，使刺三加根粉末中的油脂溶解到石油醚中，也可以去除大多數溶劑型的有機物色素，重復2 次，至石油醚層幾乎無色，第二次進行抽濾，傾去醚液，濾渣樣品置于通風處自然干燥備用。準確稱取一定量的上述干燥的濾渣樣品，加入一定料液比的乙醇水溶液，置于超聲波中，在一定溫度下提取一定時間后，將提取液冷卻、離心、分離，取上清液即得樣品總多酚提取液。

1.3.2 沒食子酸標準曲線繪制

稱取 0.5 g 硫酸亞鐵（FeSO4·7H2O）和 2.5 g 酒石酸鉀鈉（KNaC4H4O8·4H2O），加蒸餾水溶解并轉移至500mL容量瓶中，定容至刻度，搖勻[21]，得酒石酸亞鐵溶液。

準確稱取60.012 3 g 磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）和10.265 9 g 無水磷酸二氫鈉，用蒸餾水溶解，并轉移定容至1 000mL容量瓶中，搖勻，得pH 值為7.5 磷酸鹽緩沖液，常溫保存，備用。

準確稱取食子酸對照品0.125 2 g，置于250mL棕色容量瓶中，加蒸餾水溶解，定容至刻度，搖勻，即得沒食子酸標準溶液為0.500 8 mg/mL。

分別精密移取 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL的0.500 8 mg/mL 沒食子酸標準溶液，置于25 mL容量瓶中，加蒸餾水至體積到5.0 mL，再加入酒石酸亞鐵溶液5.0 mL，用pH 值為7.5 的磷酸鹽緩沖溶液定容至25 mL，混勻，室溫下靜置15 min，以試劑空白為參比，在540 nm 處測定其吸光度[22]。以沒食子酸標準溶液的濃度（C，mg/mL）為橫坐標，吸光度值（A）為縱坐標，繪制標準曲線得線性回歸方程：A=13.045 6 C+0.023 5（r=0.999 5）。研究結果表明，沒食子酸濃度在0.004 mg/mL～0.060 mg/mL 范圍內與吸光度呈現出良好的線性關系。

1.3.3 刺三加根中總多酚含量測定方法

準確移取2.0mL樣品提取液于容量瓶中，依次加蒸餾水至體積到5.0 mL，酒石酸亞鐵溶液5.0 mL，用pH 值為7.5 的磷酸鹽緩沖溶液定容至25 mL，混勻，室溫下靜置15 min，以試劑空白為參比，在540 nm 處測定吸光度值。并根據沒食子酸線性回歸方程計算樣品提取液中總多酚含量，同時平行試驗3 次。按下式計算總多酚提取率：總多酚提取率/%=樣品提取液中總多酚含量/樣品質量×100。

1.3.4 單因素試驗

按照1.3.1 和1.3.3 中的試驗方法對刺三加根中的總多酚進行提取和含量測定，固定超聲波的功率為100 W，乙醇體積分數分別取30%、45%、60%、75%、90%；料液比為 1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/mL）；超聲時間為 15、30、45、60、75 min；超聲溫度為 20、30、40、50、60 ℃，分別考察乙醇體積分數、料液比、提取時間和提取溫度4 個因素對刺三加根中總多酚提取率的影響[23]。

2 結果與分析

2.1 最佳吸收波長的確定

精密吸取按最優條件提取的刺三加根樣品溶液2.0 mL、沒食子酸對照溶液1.5 mL，分別置于25mL容量瓶中，依次各加入蒸餾水至體積到5.0 mL，酒石酸亞鐵溶液5.0 mL，用pH 值為7.5 的磷酸鹽緩沖溶液定容至25 mL，混勻，室溫下靜置15 min，以試劑空白為參比，在波長為400 nm～850 nm 范圍內掃描吸收光譜見圖1。

圖1 吸收光譜Fig.1 Absorption spectrum

由圖1 可知，刺三加根中總多酚的最大吸收波長是540 nm，與對照溶液沒食子酸反應后產物的最大吸收波長一致。由此本試驗的最佳吸收波長選擇為540 nm。

2.2 單因素試驗

2.2.1 乙醇體積分數對刺三加根中總多酚提取的影響

在料液比 1∶30（g/mL）、提取時間 30 min、提取溫度30 ℃條件下，采用乙醇體積分數分別為30%、45%、60%、75%、90%的溶劑進行超聲輔助提取，總多酚提取率結果見圖2。

圖2 乙醇體積分數對總多酚提取率的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on the extraction rate of total polyphenols

由圖2 可知，隨著乙醇體積分數的增加，總多酚的提取率呈下降趨勢，可能是因為乙醇體積分數大時，乙醇引起蛋白質變性在細胞壁形成致密結構間接阻礙了多酚物質的溶出，也有可能是因為提取溶劑乙醇與多酚之間的極性差異增大，導致總多酚的提取率呈下降趨勢。因此，選擇乙醇體積分數為45%。

2.2.2 料液比對刺三加根中總多酚提取的影響

在乙醇體積分數45%、提取溫度30 ℃、提取時間30 min，料液比為 1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/mL）的條件下，考察不同料液比對刺三加根中總多酚提取效果的影響，總多酚提取率結果見圖3。

圖3 料液比對總多酚提取率的影響Fig.3 Effect of material-liquid rate on the extraction rate of total polyphenols

由圖3 可知，當料液比為 1∶30（g/mL）時，總多酚的提取率達到最大，隨后又減小，可能是因為當乙醇體積達到足夠大時，多酚可以全部溶出；當刺三加根粉末的量過大時，只有部分多酚溶出，導致多酚的提取率下降。因此，選擇料液比為1∶30（g/mL）。

2.2.3 提取時間對刺三加根中總多酚提取的影響

在乙醇體積分數 45%、料液比 1∶30（g/mL）、提取溫度30 ℃條件下，考察超聲輔助提取時間對刺三加根中總多酚提取效果的影響，總多酚提取率結果見圖4。

圖4 提取時間對總多酚提取率的影響Fig.4 Effect of extraction time on the extraction rate of total polyphenols

由圖4 可知，在 15 min～45 min 內，刺三加根中總多酚提取率呈迅速增加的趨勢，當提取時間達到45 min時，總多酚的提取率達到最大值。但超過45 min 后，多酚提取率則呈下降趨勢，其原因可能是隨著超聲輔助提取時間的延長，會使得一些醇溶性雜質成分的溶出量增加，這些成分與多酚類化合物競爭同乙醇分子的結合，從而導致多酚提取率下降[23]。因此，選擇超聲輔助提取時間為45 min。

2.2.4 提取溫度對刺三加根中總多酚提取的影響

準確稱取0.5 g 樣品5 份，加入45%的乙醇溶液15mL，分別在 20、30、40、50、60 ℃超聲輔助提取 45 min，提取液冷卻后離心分離，取上清液進行測定，計算總多酚的提取率，總多酚提取率結果見圖5。

圖5 提取溫度對總多酚提取率的影響Fig.5 Effect of extraction temperature on the extraction rate of total polyphenols

由圖5 可知，超聲溫度從20 ℃增加到50 ℃時，總多酚提取率呈增加趨勢，后隨著溫度增加，總多酚提取率有所下降，可能是溫度過高，總多酚的分子結構受到破壞，從而導致總多酚提取率下降，故選擇超聲輔助提取的溫度為50 ℃。

2.3 正交試驗

依據單因素試驗結果確定4 個因素的合理水平，采用L9（34）進行正交試驗設計，因素水平表見表1。

表1 正交試驗因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

以刺三加根中總多酚的提取率為考察指標，正交試驗設計優化總多酚最佳超聲輔助提取工藝，正交試驗結果見表2。

表2 正交試驗結果Table 2 Result of orthogonal experiment

由表2 分析可知，極差最大的為D 因素，影響刺三加根中總多酚提取率的主次因素為：D＞B＞C＞A，即在一定范圍內，超聲輔助提取溫度對總多酚提取率影響最大，然后依次是料液比、超聲時間、乙醇體積分數。各因素的最佳組合為D3B2C2A1，即提取條件為提取溫度 60 ℃、料液比 1∶30（g/mL）、提取時間 45 min、乙醇體積分數為35 %。此條件下多酚的提取率最高為1.37%，高于正交試驗中每次試驗的測定結果。

為了進一步確定各因素對刺三加根中總多酚提取效果的影響，對表2 結果進行方差分析和顯著性檢驗，由于A 因素的R 值最小，將其作為空白列進行計算，結果見表3。由表3 可以看出，料液比和超聲溫度對結果的影響是顯著的，乙醇體積分數和提取時間對結果并無顯著影響。

表3 正交試驗結果方差分析表Table 3 Analysis of variance for the result of orthogonal experiment

2.4 方法學驗證

2.4.1 精密度試驗

精密移取1.5mL沒食子酸對照溶液6 份，按照1.3.3 試驗方法測定，記錄其吸光度，計算得相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為 0.83%（n=6），這表明儀器精密度是良好的。

2.4.2 重復性試驗

取同一批次的刺三加根6 份，按最佳提取條件制備樣品提取液，按照1.3.3 試驗方法測定其吸光度，計算吸光度的RSD 為1.38%，表明該方法重復性好。

2.4.3 穩定性試驗

取同一批次的樣品提取液，分別在 0.25、1、2、4、6、8、12 h 按1.3.3 的試驗方法測定其吸光度，結果表明，溶液顯色后0.25 h～12 h 時間內樣品溶液的吸光度變化不大，計算其RSD 為0.69%，說明這12 h 內反應產物的穩定性良好。

2.4.4 加標回收率試驗

按最佳提取條件平行制備樣品提取液6 份，各準確吸取1.5mL樣品溶液，置25mL棕色容量瓶中，按1.3.3 項下試驗方法，測定其吸光度，并計算總多酚含量。從上述6 份樣品溶液中各移取1.5 mL，沒食子酸標準溶液1.0 mL，置25mL棕色容量瓶中，按1.3.3 項下試驗方法，測定其吸光度，并計算總多酚含量，結果見表4。

表4 加標回收率試驗結果Table 4 Experiment results of average recovery

由表4 可知，總多酚平均回收率為99.59%，RSD為1.27%。

2.5 樣品含量測定

結合單因素試驗和正交試驗優化結果分析，選擇乙醇體積分數 35 %、料液比 1∶30（g/mL）、提取時間45 min、提取溫度60 ℃的條件下，制備樣品提取液，同時測定其吸光度，代入線性回歸方程計算總多酚含量，并計算總多酚提取率，結果見表5。

由表5 可知，其總多酚平均值為13.45 mg/g，RSD（n=6）為1.38%，總多酚提取率平均值為1.34%。

3 結論與討論

本試驗選擇乙醇為提取溶劑，采用超聲波輔助提取刺三加根中總多酚。通過單因素試驗和L9（34）正交試驗，優化超聲輔助提取刺三加根中總多酚的最佳工藝條件為：乙醇體積分數為35%、料液比1∶30（g/mL）、提取時間45 min、提取溫度60 ℃，在此條件下，總多酚的提取率最高，平均值為1.34%。

總多酚的含量測定方法有高錳酸鉀、福林酚、鐵氰化鉀分光光度、高效液相色譜和酒石酸亞鐵等方法，由于高錳酸鉀滴定法滴定終點較難觀察；福林酚法靈敏度較高，簡便易行，但對環境溫度要求高；鐵氰化鉀分光光度法對時間敏感，且顯色穩定時間短，對測定條件要求嚴格；高效液相色譜法靈敏度高、專屬性強，分析成本高，儀器價格及日常維護費用貴。因此，本試驗選用酒石酸亞鐵分光光度法測定刺三加根中總多酚的含量。結果表明，該方法操作簡單易行，重復性、穩定性好，精密度高，可用于刺三加根中總多酚的含量測定。