采用生物信息學方法篩選與肺腺癌患者預后相關的LncRNAs*

陶 冶，李云慧，黃俊杰，梁 彬△

(1.中國醫科大學生命科學學院生物信息學教研室，遼寧沈陽 110122；2.北部戰區總醫院和平院區檢驗科，遼寧沈陽 110003)

據2018年185個國家的統計結果顯示，肺癌占所有癌癥病例的11.6%，占癌癥總死亡人數的18.4%，位列我國癌癥發病率之首[1]。非小細胞肺癌是肺癌常見形式，包括3種組織病理學亞型：腺癌、鱗狀細胞癌和大細胞癌。肺腺癌是最常見的變異型，約占肺癌病例的40.0%[2-3]。目前，雖然在肺癌手術、化療和分子靶向治療技術方面取得了進展，但肺癌仍然是全球癌癥死亡的主要原因[3-4]。長鏈非編碼RNA(lncRNAs)是大于200 bp的非編碼RNA，主要通過表觀遺傳學、轉錄及轉錄后水平調控基因表達[5]。研究結果顯示，lncRNAs是重要的調控因子，調控細胞增殖、分化、侵襲以及轉移[6]。本研究利用TCGA中肺腺癌患者的RNA測序數據，采用生物信息學技術手段，篩選肺腺癌患者差異表達的lncRNAs，探討差異表達的lncRNAs與肺腺癌臨床參數的相關性及與肺腺癌患者預后的關系。

1 資料與方法

1.1數據下載 從TCGA數據庫(https://cancergenome.nih.gov/)下載肺腺癌患者癌組織和癌旁組織的lncRNAs測序數據，cBioPortal數據庫(http://www.cbioportal.org/)下載相應的臨床資料。其中男219例，年齡38～88 歲，平均(65.66±9.77)歲；女259例，年齡40～87歲，平均(65.75±9.72)歲。樣本的納入標準：(1)經病理證實為原發性肺腺癌，術前未經過任何放化療；(2)具有完整的臨床分期資料及預后信息。共計478例肺腺癌患者納入分析，臨床特點見表1。本研究中肺腺癌的分期采用TNM分期方法，其中T分期與腫瘤浸潤深度相關，分期越高，浸潤深度越大；N分期與淋巴結轉移情況相關，分期越高，轉移淋巴結越多；M分期與腫瘤遠處轉移相關。肺腺癌患者在年齡和性別上差異無統計學意義，具有可比性。

表1 肺腺癌患者的臨床特點

注：NA表示無法確定;TX表示原發腫瘤的情況無法評估；NX表示區域淋巴結情況無法評估；MX表示腫瘤有無遠處轉移無法評估

1.2數據處理 應用R語言程序包對TCGA數據庫下載的lncRNAs數據信息進行差異分析，篩選肺腺癌組織和癌旁組織中差異表達的lncRNAs。篩選標準：log2|差異倍數(FC)≥1，P<0.05。

1.3篩選與肺腺癌患者預后相關的lncRNAs 對肺腺癌患者癌組織中多個差異表達的lncRNAs進行分組，根據每個lncRNA的測序數據中值分成高表達組和低表達組。應用Kaplan-Meier生存曲線和Log-Rank檢驗方法分別對高表達和低表達的lncRNA與總體生存期(OS)的相關性進行分析，篩選出與總體生存期顯著相關的lncRNAs。應用單因素和多因素Cox回歸模型對與OS相關的lncRNAs行進一步分析。

1.4差異表達lncRNAs與臨床參數的關系 根據患者年齡、TNM分期、總體生存狀態進行分組，分析與OS相關的lncRNAs與各臨床參數的關系。

1.5統計學處理 采用SPSS20.0統計學軟件包進行統計學分析。計數資料采用率(%)表示。應用Kaplan-Meier曲線法進行生存分析，Log-Rank方法檢驗各lncRNA高表達和低表達組生存率差異是否具有統計學意義。多因素預后分析采用Cox比例風險回歸模型。lncRNA表達和臨床參數之間的關系采用χ2檢驗。P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1差異表達lncRNAs的篩選 應用R語言程序包篩選出癌組織和癌旁組織差異表達的lncRNAs有168個，其中上調的lncRNA有128個，下調的lncRNAs有40個。癌組織和癌旁組織中差異表達lncRNAs的分布見圖1。

注：FDR表示錯誤發現率;FC表示差異倍數；紅色表示上調lncRNAs，綠色表示下調lncRNAs

圖1癌組織和癌旁組織差異表達的lncRNAs分布火山圖

2.2與OS相關的lncRNAs篩選 根據每個lncRNA的表達中值，分成高表達組和低表達組。采用Kaplan-Meier生存曲線和Log-Rank檢驗分析168個差異表達的lncRNAs與肺腺癌患者預后的關系。結果顯示，RP11-490M8.1(P=0.024)、RP11-132A1.4(P=0.001)、DRAIC(P=0.007)、LINC00942(P=0.001)、TMPO-AS1(P=0.005)、Z83851.4(P<0.001)和LINC01133(P=0.022)與肺腺癌患者的預后呈顯著相關。高表達RP11-490M8.1、RP11-132A1.4、LINC00942、TMPO-AS1、Z83851.4和LINC01133與預后差顯著相關，而低表達DRAIC與預后差顯著相關。見圖2。

采用單因素和多因素Cox回歸分析結果進一步證實，差異表達的lncRNAs與肺腺癌患者的預后相關，高表達RP11-490M8.1(P=0.047)、RP11-132A1.4(P=0.049)、LINC00942(P=0.033)、TMPO-AS1(P=0.006)、Z83851.4(P=0.032)、LINC01133(P=0.035)和低表達DRAIC(P=0.023)是肺腺癌患者預后不良的獨立預后因素。見表2。

注：A為RP11-490M8.1；B為RP11-132A1.4；C為DRAIC；D為LINC00942；E為TMPO-AS1；F為Z83851.4；G為LINC01133

表2 肺腺癌患者差異表達lncRNAs的單因素和多因素Cox回歸分析

注：HR表示風險比值

2.3與預后顯著相關的lncRNAs和臨床參數的關系 對與預后顯著相關的7個lncRNAs和各臨床參數之間的關系進行分析，結果顯示，RP11-132A1.4 表達水平與年齡(P=0.016)、淋巴結轉移(P=0.016)、臨床分期(P<0.001)和T分期(P=0.001)顯著相關；DRAIC表達水平與年齡(P=0.027)顯著相關；LINC00942表達水平與淋巴結轉移(P<0.001)和臨床分期(P=0.001)顯著相關；TMPO-AS1表達水平與臨床分期(P=0.008)顯著相關；Z83851.4表達水平與淋巴結轉移(P=0.008)顯著相關；LINC01133與T分期(P=0.049)顯著相關。見表2。

3 討 論

lncRNAs是一種長度大于200個核苷酸，缺乏完整的特異性開放閱讀框，無編碼蛋白質功能的核酸分子。大量研究結果顯示lncRNAs通過染色質重塑，組蛋白修飾和RNA代謝等多種生物學過程在表觀遺傳、轉錄和轉錄后水平調控基因表達[7-8]。lncRNA發揮內源性“miRNA 海綿”功能與miRNA相互作用，參與靶基因的表達調控；反之，miRNA通過RNA誘導沉默復合物調控lncRNAs發揮生物學功能，兩者又可競爭結合mRNAs，共同參與疾病的發生發展過程[9]。

lncRNAs與多種癌癥相關，其異常表達和突變與腫瘤的增殖、凋亡、侵襲、遷移及藥物敏感性密切相關。研究結果顯示，在多種腫瘤患者中，某些lncRNAs表達發生改變，可作為癌癥診斷及預后的標志物[10]。TCGA癌癥數據庫是由美國國家癌癥研究所及國家人類基因組研究所聯合建立，其中包含豐富的數據類型和腫瘤類型。本研究采用生物信息學技術手段，篩選肺腺癌患者差異表達的lncRNAs 168個進行預后分析，總體生存分析顯示：RP11-490M8.1、RP11-132A1.4、DRAIC、LINC00942、TMPO-AS1、Z83851.4和LINC01133是肺腺癌患者獨立預后的不良因素。YANG等[11]報道LINC01133通過充當miR-106a-3p的ceRNA來調控APC的表達和Wnt/β-catenin通路，抑制胃癌的進展和轉移。也有研究證明，LINC01133低表達影響結直腸癌的轉移和預后[12]。ZANG等[13]報道敲除LINC01133減少非小細胞肺癌腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲以及誘導細胞凋亡發揮抑瘤作用。也有研究發現LINC01133是食管鱗狀細胞癌預后的生物標志物和治療靶點[14]。HUANG等[15]報道，在前列腺癌細胞中TMPO-AS1過度表達促進細胞周期的進展、腫瘤細胞遷移和增殖，抑制細胞凋亡。也有研究證明，DRAIC/PCAT29的表達水平與前列腺癌的發生和進展有關[16]。其他的lncRNAs目前還未有報道。

此外，本研究發現RP11-132A1.4、LINC00942和Z83851.4與淋巴結轉移顯著相關，RP11-132A1.4、LINC00942和TMPO-AS1與臨床分期顯著相關，RP11-132A1.4和LINC01133與T分期顯著相關，提示上述lncRNAs可能參與肺腺癌的發生發展過程，在肺腺癌惡性進程中發揮重要作用。

4 結 論

本研究對TCGA數據庫中肺腺癌患者大數據進行分析，篩選出與肺腺癌預后顯著相關的lncRNAs:RP11-490M8.1、RP11-132A1.4、DRAIC、LINC00942、TMPO-AS1、Z83851.4和LINC01133。本研究結果提示上述lncRNAs分別與各臨床參數存在顯著相關性，可能為肺腺癌機制的研究提供理論依據，為尋找肺腺癌診斷和預后新的分子標志物以及個性化治療方案提供新的思路。