支原體感染與類風濕關節炎發病相關性研究

李曉瑩 宋亞麗 陳臘梅 王盛華 路 麒

類風濕關節炎是一種常見的系統性炎性自身免疫性疾病，具有較高的發病率、致殘率，其發病機制表現十分復雜，臨床醫學研究尚未完全明確，涉及抗原、趨化因子、一系列的免疫反應、巨噬細胞及細胞因子等多種因素，最終造成軟骨、骨出現降解，進而導致關節畸形、關節強直[1，2]。目前認為未引起膿毒血癥的慢性感染與類風濕關節炎存在一定關聯性，其能作為誘因、病因造成類風濕關節炎發病，或進一步加重病情，增加復發風險[3]。支原體感染在類風濕關節炎發病中的作用逐漸受到關注，動物模型與患者關節液內分離出支原體。但支原體的體外培養時間長、難度大，加之易受采樣及運送、保存、用藥等相關因素影響了研究結果[4]?；诖?，本研究通過收集患者體液進行PCR檢查，探討支原體感染與類風濕關節炎發病的相關性。

1 資料與方法

1.1 入選標準 確診為類風濕關節炎，患者及其家屬對本研究均知情，并簽署知情同意書。排除標準:①合并有嚴重的高血脂、高血壓、血栓性疾病、糖尿病、心腦血管疾病、血小板疾病及肝腎功能異常等疾??；②重疊其他類型風濕病[5]；③并發惡性腫瘤；④合并沙眼衣原體感染或其他嚴重感染者。

1.2 一般資料 選取2017年1～12月期間在我院接受診治的120例類風濕關節炎患者作為研究對象，均符合入選標準。其中男57例，女63例，年齡40～52歲，平均(45.6±8.5)歲；病程1～12年，平均(5.2±2.3)年。

1.3 方法

1.3.1 采集標本 所有患者入院接受診治時均采集咽拭子，并采集部分患者的尿道拭子(57例)、關節液(43例)、宮頸拭子(20例)標本。(1)男性患者：從前尿道1～2 cm位置用無菌拭子取男性患者的尿道分泌物。(2)女性患者：采集患者宮頸分泌物，采集標本時需先將宮頸口的多余黏液擦去，并于宮頸管內1～2 cm位置用另一拭子取宮頸分泌物，采集過程中需在宮頸中旋轉，停留>20 s，便于獲取更多細胞。

采集標本過程中需特別注意支原體對相關細胞表面存在很強的親和力，需盡量多采集細胞，采集標本后需快速接種，避免在室溫、普通冰箱內長時間保存，預防拭子干燥而導致支原體活力下降或死亡。

1.3.2 標本處理 將采集的所有拭子標本立即放入內含無菌生理鹽水1～2 mL的潔凈試管內進行振蕩、洗滌，并用移液器收取混懸液400 L后放入0.5 mL的離心管內。而血液標本，在吸取0.5 mL血清后放入0.5 mL的離心管內，后經15000 r/min離心5 min，將上清液吸棄，并加入裂解液(由0.5%的非離子去污劑配制成的400 g/L蛋白酶K溶液)，后開展55℃水浴1 h，再開展95℃水浴5 min。最后經10000 r/min離心30 s，留取上清液，即為nPCR模板液[6]。

1.3.3 支原體檢測 所有標本均用PCR方法檢測解脲脲原體(Uu)、關節炎支原體(Mar)、人型支原體(Mh)及發酵支原體(Mf)等，所有操作均參照說明書執行。結合套式PCR產物應用全自動熒光法分析DNA序列。

1.3.4 骨密度檢測 采用骨密度檢測儀對患者腰椎L2-4、左股骨頸骨密度進行檢測。

1.3.5 影像學檢查 采用X線等影像學方法對患者雙手及腕關節進行檢查，判斷關節破壞改變，根據關節破壞程度分成4期，I期：關節周圍的軟組織出現腫脹陰影，且關節端產生骨質疏松；II期：關節間隙由于軟骨破壞而不斷狹窄；III期：關節面產生蟲鑿樣的破壞性改變；IV期：關節出現半脫位情況，且關節破壞后發生纖維性、骨性強直[7]。

1.4 類風濕關節炎病情評估 依據28個關節平均疾病活動性指數(DAS28)相關評分標準對類風濕關節炎的病情活動性進行評估，包括觸痛關節數、腫脹關節數等內容，總分0～10分，評分越高代表病情活動性越高[8]。

2 結果

2.1 支原體檢測情況 120例類風濕關節炎患者Uu、Mar、Mh及Mf檢測結果顯示，部分患者咽拭子、尿道拭子、關節液檢出支原體。見表1。

表1 120例類風濕關節炎患者支原體檢測陽性情況 n(%)

2.2 Uu陽性與陰性患者檢測結果 類風濕關節炎患者中Uu陽性、陰性者骨密度減少或骨質疏松、DAS3.2～5.1、DAS>5.1、影像學差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 120例類風濕關節炎患者中Uu陽性、陰性相關檢測結果比較 n(%)

3 討論

類風濕關節炎是常見的慢性、進行性炎癥疾病，其發病與細菌誘發因素的相關性是臨床關注重點之一，包括穿透支原體、逆轉錄病毒及發酵支原體等相關微生物[9,10]。支原體是指缺乏細胞壁的最小原核型微生物，結構簡單，多數呈球形，沒有細胞壁[11]。解脲脲原體作為常見的支原體，屬于支原科目，是支原體科及脲原體屬之一[12]。依據分析生物學特征能分成2大生物群、14個血清型，其中生物1群主要包括1、36、14等較小的基因組，在支原體感染內約占90.0%～92.0%[13]；而生物2群主要包括余下10個較大血清型基因組，在支原體感染內約占8.0%～10.0%，由患者尿道分離獲取的主要表現為4型基因組[14]。目前，臨床醫學多認為支原體致病性主要來源于細胞膜表面存在的脂質相關膜蛋白(LAMPs)，脂蛋白是其主要成分，存在良好的抗原性，能對宿主細胞的免疫應答進行激發，且能與宿主細胞產生相互作用，研究發現支原體感染和類風濕關節炎發病存在相關性[15]。

本研究結果顯示，類風濕關節炎患者的咽拭子、尿道拭子、關節液均檢出不同比例的支原體，其中Uu、Mh的檢出率高于Mar、Mf。說明支原體感染與類風濕關節炎發病存在一定相關性，分析支原體感染在類風濕關節炎發病過程中可能起到輔助作用[16]。近年來，隨著臨床檢測、診斷醫學法發展，支原體生物學特征的深入研究顯示，不同支原體存在相同生物學特征，均可牢固的黏附于宿主細胞，能進入細胞而產生細胞毒性作用[18]；且均能導致單核/巨核細胞、NK細胞及肺成纖維細胞的相關非特異性免疫釋放過量白細胞介素、腫瘤壞死因子-α、干擾素等相關細胞因子、一氧化氮。研究顯示，支原體等相關微生物能經直接感染及間接交叉免疫反應、超抗原、蛋白抗原等相關途徑產生自身免疫反應。本研究結果表明，類風濕關節炎患者中Uu陽性、陰性者在骨密度減少或骨質疏松、DAS3.2-5.1、DAS>5.1、影像學II期方面存在一定差異；說明Uu感染和類風濕關節炎的病情活動存在相關性，同時Uu感染可能對成骨細胞、破骨細胞的相關動態平衡造成破壞，對骨質沉積造成不良影響。類風濕關節炎極大地影響患者的生活質量，故對疾病活動性及發展進行評估是目前臨床醫生關注的熱點[4]。DAS28是臨床評估類風濕關節炎病情活動的綜合評估標準，其依據患者實驗室指標、關節腫痛數，對疾病活動性進行客觀評價。本研究對入住患者的DAS28評分分析也進一步提示支原體感染與類風濕關節炎病情活動的相關性。Uu等多種支原體和人類具有共同抗原，且支原體能對人體免疫機能、細胞功能進行干擾。而滑膜組織內高水平核因子kB受體活化因子配體能對破骨細胞凋亡進行抑制，增強受累關節破骨細胞分化，增加活性，將破骨細胞激活使骨組織脫鈣，并釋放一定組織蛋白酶使骨基質蛋白降解，導致受累關節破壞進一步加重。但無法明確支原體感染在類風濕關節炎發病機制中起到的作用是屬于激發者或是伴隨者，后面需增加樣本量進行深入性研究。

綜上所述，解脲脲原體等相關支原體感染在類風濕關節炎發病早期中起到重要作用，與患者關節骨質破壞及關節功能障礙、生活質量降低存在一定相關性，檢測支原體水平能從一定程度上評估類風濕關節炎病情進展。