茶葉多糖的提取與結構分析

汪雨 郭軍 陳壯

摘? 要：以本地綠茶為研究對象，采用苯酚-硫酸法測定茶葉多糖含量，通過研究不同因素條件下的提取率，確定最佳工藝為：超聲提取功率70W，提取時間1h，提取溫度60℃，料液比1∶30，提取次數3次;通過紫外光譜圖和紅外光譜圖，確定多糖中存在特征官能團。

關鍵詞：茶多糖;超聲;提取

中圖分類號 TS272.4文獻標識碼 A文章編號 1007-7731（2019）12-0025-4

茶葉是世界上幾大重要飲料之一，我國茶資源豐富，是最早飲茶的國家，經過幾千年的傳承和延續，飲茶在我國已經成為一種文化[1]，飲茶與人體健康的響應機制是眾多學者關注的對象[2，3]。茶葉多糖是茶葉中由大量單糖通過糖苷鍵連接而成的天然大分子活性物質，具有多種保健效果，是茶葉中的關鍵性功能成分之一，具有抗氧化、抗衰老、增強免疫力功能。茶葉多糖以降低血糖血壓和防治糖尿病成為研究的熱點[4，5]，較其它保健品具有吸收快、代謝徹底、無殘留等優點，基本無毒副作用[6]。本文通過苯酚-硫酸法測定茶葉多糖的濃度，探究改變外在實驗條件，研究茶葉多糖提取率，并對茶葉多糖的結構進行分析，為優化茶葉多糖的提取工藝和茶葉多糖的制備提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 茶葉購于茶農，把準備好的干茶葉放入粉碎機中粉碎，將粉碎后過30目篩的茶葉粉末裝好備用;無水乙醇、正丁醇、濃硫酸、苯酚、三氯乙烷、異戊醇等分析純，上海國藥生產。

恒溫水浴鍋（HH-8）：金壇市杰瑞電器有限公司;小型超微粉碎機（WK-150A）：山東省青州市精誠機械制造有限公司;真空干燥箱（OZF-0690）：上海新苗醫療機械制造有限公司;電子天平（FA2104N）：上海箐海儀器有限公司;臺式低速離心機（TDZ4）：湖南赫西儀器有限公司;可見分光光度計（722）：上海奧普勒儀器有限公司;傅立葉變換紅外光譜儀（Nicolet iS-200）：美國。

1.2 實驗步驟

1.2.1 茶多糖測定方法 用苯酚-硫酸法[7]來測定茶葉多糖的濃度，以葡萄糖為標準品，配制成100mg/L的葡萄糖溶液。

茶葉多糖的提取率公式：提取率（%）=（C×稀釋倍數×V×10-6）/m×100

式中：C為分光光度計間接測定的茶葉多糖的濃度;單位：mg/L;V為提取液體積;位：mL;m為樣品質量;單位：g。

1.2.2 不同超聲功率和時間下提取多糖

1.2.2.1 不同超聲波功率提取多糖 稱取待測10.0g茶葉粉5份，加入蒸餾水，在溫度為60℃和超聲功率分別為0、50、60、70、80W條件下提取1h。提取液用4層紗布過濾后靜置3h，抽濾，濾液經離心，然后測定茶葉多糖濃度和提取率。

1.2.2.2 不同超聲時間提取多糖 稱取待測10.0g茶葉粉5份，加入蒸餾水，在溫度60℃和功率70W條件下提取，超聲提取時間分別為0.5、1、1.5、2、2.5h，提取液用4層紗布過濾后靜置3h，抽濾，濾液離心，然后測定茶葉多糖濃度和提取率。

1.2.3 超聲條件下單因素實驗

1.2.3.1 溫度對提取率的影響 稱量10.0g茶葉粉5份，加入蒸餾水，在功率70W條件下，放置于溫度不同的同一型號的超聲波清洗儀中，設定水溫分別為50、60、70、80、90℃，浸提1h，提取液用4層紗布過濾后靜置3h，抽濾，濾液離心，然后測定茶葉多糖濃度和提取率。

1.2.3.2 料液比對提取率的影響 稱量10.0g茶葉粉5份，分別加入100、200、300、400、500mL的蒸餾水，在功率70W條件下放置于60℃的超聲波清洗儀中，浸提1h，提取液用4層紗布過濾后靜置3h，抽濾，濾液離心，然后測定茶葉多糖濃度和提取率。

1.2.3.3 提取次數對提取率的影響 稱量10.0g茶葉粉5份，加入蒸餾水，放置于60℃超聲波清洗儀中，在功率70W條件下，分別提取1、2、3、4、5次，一次1h，提取液用4層紗布過濾后靜置3h，抽濾，濾液離心，然后測定茶葉多糖濃度和提取率。

1.2.4 茶葉多糖脫蛋白 把多糖溶于20mL的蒸餾水中，并用三氯甲烷和正丁醇（4∶1）配制4份各10mL的sevag試劑，分別加入到多糖溶液中。充分振蕩30min后放入到離心機上以3000r/min的速度離心1min。然后留下上清液，繼續加入相當于多糖溶液1/3體積的sevag試劑，重復上述操作3次。向剩下的多糖溶液中加入2倍的無水乙醇，冷藏靜置2h，然后離心3min，用水洗滌沉淀后，加入丙酮脫水，真空冷凍干燥12h，得到除掉蛋白的多糖。

1.2.5 紅外與紫外實驗 取少量除去蛋白的多糖，加蒸餾水溶解，在200～700nm的波長范圍內進行紫外實驗，保存所得光譜。取2mg精糖放入研缽中，并加入200mgKBr在研缽中充分研磨壓片，然后在4000～400cm-1處進行紅外光譜實驗。

2 結果與分析

2.1 標準曲線 依據分光光度法在波長490nm處測定吸光度A490，繪制出標準曲線，如圖1所示，得回歸方程為：A=0.0128C-0.0547，R=0.9987。

2.2 不同因素對多糖提取率的影響

2.2.1 不同超聲波功率對提取率的影響 由圖2可知，隨著超聲波功率的增加，茶葉多糖提取率也呈現上升趨勢，當超聲波功率大于70W之后，提取率增加不明顯，沒有超聲情況下提取率最低。

2.2.2 不同超聲時間對提取率的影響 由圖3可知，茶葉多糖提取率隨著超聲浸提時間的增加而逐漸升高，1h后，提取率增加緩慢，而隨著時間的延長生產成本會增加，因此浸提時間應選在1h適宜。超聲波可在液體中產生空穴作用，空穴作用產生的沖擊波和射流可破壞植物細胞和細胞膜結構，從而增加細胞內溶物通過[8，9]。經過超聲浸提比不經過超聲浸提得到的多糖要多，而且超聲提取的時間加長會增加多糖的提取，因此可以推斷出超聲在一定程度上有利于茶葉多糖的提取。

2.2.3 超聲提取溫度與提取率的關系 由圖4可知，伴隨溫度的升高，多糖的提取率漸漸升高，這表明溫度愈高對茶葉細胞的破壞作用愈大，有益于多糖的浸出。但在90℃左右時，雖然提取率達到1.63%，但茶葉提取液的粘度變得過大，這也許是因為：一是茶葉細胞在高溫下會處于“崩潰”、溶解的狀況;二是茶葉多糖中含有的淀粉在90℃時會處于糊化的狀態，茶葉提取液就形成一種粘稠的糊狀，而這種高黏的液體對固液分離不利[10，11]。所以在茶葉多糖的工業化生產中，提取溫度不得超過90℃，在60℃時提取的多糖與在70℃時提取的多糖質量相差不大，隨著提取溫度的升高，分子熱運動會變得更為劇烈，多糖提取率也會隨之增加。由于多糖是活性物質，溫度過高易破壞其結構，影響其生物活性，會對后面試驗造成不利影響，所以初步推出60℃和70℃為最佳浸提溫度。

2.2.4 料液比對提取率的影響 由圖5可知，隨著料液比的增加，多糖的提取率也會漸漸增加，但當料液比到達1∶30后，多糖的提取率的增加就變得遲緩。而體積的增加會延長濃縮時間，生產成本增加，所以料液比選擇在1∶30較好。

2.2.5 提取次數對提取率的影響 由圖6可知提取次數對多糖提取率的影響也較為突顯，當提取次數從1到3次時，多糖提取率增加快速，從3到5次時，多糖提取率上升相當遲緩。所以，從節約成本和提高效率方面考慮提取次數選擇3次適宜。

2.3 茶葉多糖的紅外表征 圖7是茶葉多糖在4000～400cm-1的波長范圍內的紅外光譜圖，對照以上結果可知3650～3150cm-1處的較寬吸收峰是O—H和N—H伸縮振動峰，在2910cm-1周圍存在的峰為甲基（—CH3）和次甲基（—CH2）的C—H伸縮振動的信號，1650cm-1處的峰是多糖水合吸收振動吸收峰，是由糖環上的糖苷鍵和酰氨基上的C[]O伸縮振動引起的，1360cm-1處的吸收峰是C—H鍵的變角振動，1240cm-1處的峰是C—O—C非對稱伸縮振動峰[12]。887cm-1是吡喃糖苷的特征吸收峰，652cm-1出現吸收峰，表明茶多糖結構中存在酰胺基。

2.4 茶葉多糖的紫外表征 由圖8～11用紫外掃描儀在200～700nm波長范圍內進行掃描得到的結果可知：該紫外吸收光譜圖在200～280nm波長處有吸收峰，說明其中含有肽鍵，表明多糖內含有蛋白質和核酸[13]。在圖4中，溫度升高會增加多糖的產量，但是溫度過高會破壞多糖結構影響其活性，而且60℃和70℃下提取出的多糖相差很少，從節約能源的角度看，60℃為最佳浸提溫度。在圖7中可以看出，紅外光譜的在1650cm-1左右出現吸收峰，這是多糖中C[]O伸縮振動引起的，但同時也是酰氨基上的C[]O伸縮振動引起的，這說明多糖中有蛋白質的存在[14]。由圖8，圖9，圖10，圖11可以看出，207nm處為茶多糖的特征吸收峰，274nm處為蛋白質吸收峰，無超聲情況下，50℃和60℃時蛋白質的吸收峰較低，但是在70℃時蛋白質的吸收峰較高，說明溫度增加了蛋白質的提取，在該溫度下超聲提取時，蛋白質的吸收峰明顯降低，可能是超聲引起了蛋白質的變性，從而引起蛋白質溶解度降低，說明超聲對蛋白質提取有抑制作用。

4 結論

本實驗對茶多糖提取工藝進行研究，通過對超聲提取功率、提取時間、提取溫度、料液比、提取次數進行單因素實驗，得出最佳提取功率是70W，提取時間為1h，提取溫度是60℃，料液比為1∶30，提取次數為3次。通過紅外光譜和紫外光譜實驗確定多糖中存在特征官能團，確定茶多糖是一種含有吡喃環和糖醛酸的蛋白多糖復合物[15]。

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（責編：王慧晴）