哈茨木霉對鴨梨采后青霉病的抑制效果及機理

張華 孫穎穎 于晨

摘要：以鴨梨果實為實驗材料，研究了哈茨木霉對貯藏在常溫條件（20±1°C）下鴨梨果實采后青霉病的抑制效果及相關機理。結果表明，哈茨木霉顯著抑制了青霉病的發病率和病斑直徑。哈茨木霉處理提高了鴨梨果實中幾丁質酶（chitinase，CHI）和β-1，3-葡聚糖酶（β-1，3-glucanase，GLU）的活性，誘導了鴨梨果實中過氧化氫酶（catalase，CAT）、多酚氧化酶（polyphenoloxidase，PPO）和過氧化物酶（peroxidase，POD）等抗病相關酶活性的提高。哈茨木霉通過誘導提高抗病性相關酶活性，從而減輕鴨梨果實采后青霉病的發生。

關鍵詞：哈茨木霉;鴨梨;青霉病;誘導抗病性

中圖分類號 TS255.3文獻標識碼 A文章編號 1007-7731（2019）12-0084-3

Abstract：The effects of Trichoderma harzianum on blue mold decay in harvested Yali pear fruit stored at 20±1°C and the possible mechanisms were investigated. The results showed that fruit treated with Trichoderma harzianum had significantly lower disease incidence and smaller lesion diameter than the control fruit did. Trichoderma harzianum treatment significantly enhanced activities of chitinase（CHI），β-1，3-glucanase（GLU），catalase（CAT），peroxidase（POD），and polyphenoloxidase（PPO）. The experimental results suggested that Trichoderma harzianum could effectively suppress blue mold decay in pear fruit may be related to the induction o f defensiv e enzyme activities.

Key words：Trichoderma harzianum;Pyrus bretschneideri;Blue mold decay;Induced disease resistance

鴨梨（Pyrus bretschneideri Rehd.）是白梨系統中的優良品種，果實皮薄多汁，營養豐富，受到國內外消費者的歡迎，每年需求量巨大，但果實在貯藏期間易發生真菌病害，造成了巨大的損失，影響果實的貯藏和銷售。其中由擴展青霉（Penicillium expansum）引起的青霉病是鴨梨采后貯藏的主要真菌病害之一[1]。對于水果采后真菌病害的防治，傳統的方法是依靠人工合成的化學殺菌劑，但長期使用會造成真菌產生抗藥性以及農藥殘留，隨著人們環境保護意識的提高，通過生物防治的方法抑制采后病害的發展成為研究熱點。

木霉菌是防治效果非常好的生防真菌，其抗性效果在多種植物中都有報道。哈茨木霉（Trichoderma harzianum）屬于半知菌門絲孢目木霉屬，廣泛存在于不同環境中的土壤中。眾多的研究結果表明，哈茨木霉在農作物上的使用可抑制植物病原真菌、細菌、昆蟲等有害生物，同時還可以促進農作物的生長，被廣泛應用于生物防治[2]，但關于哈茨木霉對鴨梨果實采后青霉病的抑制效果及相關機理尚未見報道。因此，本試驗研究了哈茨木霉對鴨梨果實采后青霉病的抑制效果和相關機理，以期為哈茨木霉在水果采后貯運中的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗處理 哈茨木霉在PDA培養基（馬鈴薯：200g;葡萄糖：20g;瓊脂：20g;水：1000mL）上擴大培養15d，使用血球計數板配置濃度為1×108個/mL的孢子懸浮液。將青霉菌孢子接種于PDA培養基上擴大培養7d，使用血球計數板配置濃度為5×104個/mL的孢子懸浮液。鴨梨果實采摘自山東省聊城市冠縣果園，選擇大小、成熟度一致，無物理損傷和病蟲害的果實，隨機分成2組，為避免交叉感染，先用75%的酒精擦拭鴨梨果實表面需要接種的部位，用無菌打孔器在果實的赤道部位打孔（深4mm，直徑2mm）。處理組用移液槍注入25?L的哈茨木霉孢子懸浮液，對照組注入等量的無菌水，2h后在打孔處注入15?L的青霉菌孢子菌懸液。處理完畢后，用0.01mm厚的聚乙烯保鮮袋分裝果實，將果實貯藏于20±1°C、相對濕度為90%的生化培養箱中5d，在貯藏的第1、3、5d測量鴨梨果實的發病率和病斑直徑，同時取果實病斑外圍2～10mm的樣品，測定其它生化指標，每個處理20個果實，重復3次。

1.2 試驗方法

1.2.1 鴨梨的發病率和病斑直徑的測定 使用游標卡尺測量鴨梨果實的病斑直徑，當病斑直徑大于2mm時，認定為是發病，發病率（%）=（發病果個數/果實總數）×100。

1.2.2 鴨梨果實組織中抗病相關酶活性的測定 稱取1g鴨梨果實組織，冰浴條件下用檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液（5mL，pH5.0）勻漿，4℃離心（12000r/min）15min，所得上清液用于測定幾丁質酶和β-1，3-葡聚糖酶活性。根據王雷等的方法[3]，以每分鐘增加0.001個光密度所需要的酶量為1個幾丁質酶活力單位;以每小時生成1mg葡萄糖為1個β-1，3-葡聚糖酶活力單位，結果表示為U mg-1protein。CAT的活性按照Liu等[4]的方法進行測定，以反應液每分鐘在240nm處吸光值變化0.001為1個酶活力單位，結果表示為U mg-1protein。PPO和POD的活性依據Jiang等[5]所述方法測量，使用磷酸鈉緩沖液（0.2M，pH6.5）勻漿1g水果組織并離心，反應體系中包含0.1mL上清液，0.2mL的鄰苯二酚，在420nm處測定吸光度值，每分鐘增加0.01為1個酶活力單位。測定POD活性時，吸光度值在470nm處的每分鐘變化為0.01為1個酶活力單位，結果表示為U mg-1protein。蛋白質含量的測定采用考馬斯亮藍法[6]。

1.3 數據統計 采用SAS 9.3對實驗數據進行分析。

2 結果與分析

2.1 對鴨梨果實青霉病的抑制效果 由擴展青霉（Penicillium expansum）引起的青霉病是鴨梨采后貯藏的主要真菌病害，其引起的腐爛造成了巨大的經濟損失。如圖1所示，鴨梨果實在采后常溫（20±1°C）貯藏過程中，通過穿刺接種青霉菌后，腐爛的發病率和病斑直徑表現出了上升的趨勢，接種哈茨木霉處理能夠抑制鴨梨果實青霉病的擴展，這說明哈茨木霉處理可以控制鴨梨果實采后的青霉病。貯藏5d后，處理組果實的病斑直徑比對照組果實少49.6%。

2.2 對鴨梨果實CHI和GLU活性的影響 由圖2可見，對照組和處理組的鴨梨果實組織中幾丁質酶活性在貯藏的前3d急劇上升，隨后略有下降。與對照組相比，整個貯藏過程中接種哈茨木霉能夠顯著提高鴨梨果實的幾丁質酶活性。處理組鴨梨果實的β-1，3-葡聚糖酶活性表現出逐漸上升的趨勢，而對照組在第1天上升隨后略有下降，處理組在整個貯藏期內都顯著高于對照組。這2種酶是非常重要的抗性酶，可以破壞病原菌的細胞壁，從而抑制病原菌的生長。多種采后處理方式在草莓[3]、葡萄[5]等水果上都通過誘導提高了這2種抗性酶活性，最終提高果實的抗病性，減少采后病害的發生。

2.3 對鴨梨果實CAT活性的影響 鴨梨果實組織中CAT活性在貯藏的前3天迅速上升，隨后處理組果實略有上升而對照組的活性略有下降，在整個實驗中，哈茨木霉處理組的果實CAT活性都顯著高于對照果實。水果的抗病性與CAT活性密切相關，CAT是植物體內清除活性氧系統的主要酶，活性氧自由基的積累會降低水果的抗病性。眾多的研究結果表明，提高果實中CAT的活性，有助于提高果實的抗病性[5，7]。

2.4 對鴨梨果實POD和PPO活性的影響 由圖4可見，鴨梨果實的POD活性先上升隨后下降，處理組果實顯著高于對照組。處理組鴨梨果實的PPO活性在貯藏的前3天上升達到最大值，隨后略有下降，哈茨木霉處理顯著提高了PPO活性的上升。POD在果實中參與木質素的合成，PPO能夠提高抗菌物質的轉化，兩者都可提高果實的抗病性。Jiang等人[5]的研究結果表明，茉莉酸甲酯通過提高POD和PPO的活性提高了葡萄果實的抗病性。

3 結論

哈茨木霉處理促進了CHI、GLU、CAT、PPO及POD等抗性相關酶活性的提高，這是哈茨木霉抑制鴨梨果實采后青霉病的重要作用機理，可以有效抑制青霉菌在鴨梨果實上的發病率和病斑直徑。

參考文獻

[1]井一諾，王雷.β-氨基丁酸抑制鴨梨果實采后青霉病的機理研究[J].食品研究與開發，2017，38（12）：169–174.

[2]王男麒，黃建國，彭良志，等.哈茨木霉發酵液對柑桔采后綠霉病的防治效果研究[J].中國南方果樹，2014，43（3）：5–9.

[3]王雷，李華，張華，等.β-氨基丁酸抑制草莓低溫貯藏過程中灰霉病的效果及其機理[J].食品科學，2017，38（21）：272–278.

[4]LIU Ruiling，LAI Tongfei，XU Yong，et al. Changes in physiology and quality of Laiyang pear in long time storage[J]. Scientia Horticulturae，2013，150：31–36

[5]Jiang L，Peng J，Wang L，et al. Methyl jasmonate primes defense responses against Botrytis cinerea，and reduces disease development in harvested table grapes[J].Scientia Horticulturae，2015，192：218–223.

[6]Bradford，M.M.. A rapid and sensitive method for the quantitation ofmicrogram quantities of protein utilizing the principle–dye binding.[J].Analytical Biochemistry，1976，72，248–254.

[7]張紅印，馬龍傳，姜松，等.臭氧結合拮抗酵母對草莓采后灰霉病的控制[J].農業工程學報，2009，25（5）：258–263.

（責編：王慧晴）