燕麥片成品優勢菌的篩選及燕麥菌落總數新檢測閾值的建立

閆驍驤

摘? 要：通過對燕麥成品優勢菌的培養、篩選、分離和純化，建立新的檢測閾值并驗證，結果表明，在36℃、GB4789.2-2016規定的正常檢測接種量的培養條件下，檢測培養40h后，當菌落總數小于270cfu時，菌落總數項目檢測結果<10000cfu，食品安全符合國家標準規定。將燕麥片成品優勢菌株經過篩選、分離純化和培養后，重新接種于平板計數瓊脂培養基，對其生長特性進行研究，以期縮短燕麥菌落總數檢測時間，為行業標準技術參數的更新提供參考。

關鍵詞：燕麥;優勢菌;菌落總數;菌落檢測

中圖分類號 TS210.4? 文獻標識碼 A文章編號 1007-7731（2019）12-0125-3

燕麥作為一種新興的健康食品，其功能性成分包括但不限于β-葡聚糖、燕麥硒、燕麥酚酸、生物堿、可溶性膳食纖維、類黃酮、植酸、亞油酸、α-亞麻酸等，具有獨特的營養優勢。當前，隨著燕麥片生產工藝的逐步成熟和改進，其成品的檢測技術不斷向前發展，將推動麥類相關檢驗技術的更新，進而影響到燕麥和其他麥類行業相關檢測標準的建立與完善。為此，本研究開展了燕麥片成品優勢菌株的篩選實驗。

1 材料與方法

1.1 供試材料 采用公司實驗室篩選的燕麥優勢菌株。主要試劑和儀器如表1和表2所示，其他設備和材料按照GB4789.2-2016中第3章節的要求購買使用。供應培養基：采用GB4789.28-2013規定的平板計數瓊脂培養基。pH自然，121℃高壓滅菌15min備用。

1.2 樣品處理 利用GB4789.1-2016三級采樣方法和樣品處理方法，對燕麥成品進行隨機抽樣。將25g燕麥片溶解于225mL生理鹽水（10倍稀釋度），接種量實驗以此比例為基準進行濃縮;菌落數量測定實驗，根據需要同步展開若干個10倍梯度稀釋培養觀察過程，以保證測定結果的準確性。

1.3 燕麥優勢菌株的篩選 首先，對燕麥片成品優勢菌株進行初步培養和篩選，采用朔州市朔煤古城食品有限公司車間生產的燕麥片成品作為待檢樣品，按照國標GB4789.1-2016和GB19640-2016中規定的取樣方法進行取樣，其中n=5，c=2，m=104，M=105。采用國標GB4789.2-2016中操作要求的方法對樣品進行處理，進行菌落總數測定的實驗操作。采用外徑約為95mm、內徑約為90mm的玻璃培養平皿，傾倒培養基厚度控制在0.35～0.45mm，接種后在超凈工作臺正置約15min后，在恒溫培養箱倒置培養48h。然后挑取形態完整、菌落邊緣清晰的優勢菌，梯度稀釋平板法進一步分離純化并重復試驗。之后針對再培養的優勢菌株進行均勻涂布接種培養，分別觀察燕麥片大小片成品共6批次樣品。優勢菌落形態均呈現表面白色圓形，邊緣整齊光滑，有酵母菌特有香氣，符合酵母菌的菌落形態常見特征，判定為酵母菌。之后采用GB4789.15-2016霉菌與酵母計數中提及的選擇性培養基，馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（簡稱PDA）培養，生物顯微鏡涂片觀察，得到的分離純化后的菌株作為檢測出發菌株。

1.4 燕麥菌株生長特性指標的測量 結合燕麥產成品國標檢測要求，并充分考慮到酵母菌的菌落形態特性，邊緣整齊，易于觀察，對每個被均勻稀釋涂布的平皿出現的酵母菌落進行觀察。驗證實驗之前的實驗過程中，設立5組平行實驗，菌落生長特性指標結果，表示為酵母菌落個數平均結果（cfu/皿）。驗證試驗采用GB4789.2-2016中的規定方法，進行菌落總數測定實驗。

2 結果與分析

2.1 不同培養溫度對酵母菌落生長特性的影響 燕麥片成品在平板計數培養基培養下的優勢菌為酵母菌，酵母菌理論最適生長溫度為20～30℃。由于國標要求檢測方法的額定培養溫度為36℃，為了探測36℃培養條件下的燕麥優勢酵母菌株的生長情況，實驗設定溫度梯度為3℃，實驗中采用梯度稀釋法。設立同一樣品的菌懸液，相同稀釋度、相同接種量、不同溫度條件下進行培養，觀察所得結果見表3。由表3可知，燕麥優勢酵母菌株菌落長勢的最佳培養溫度在30～33℃附近。不同培養溫度對燕麥優勢酵母菌株菌落個數影響力比例為30℃∶33℃∶36℃∶39℃≈2∶1.81∶1.49∶1。

2.3 不同初始接種量對菌落生長特性的影響 實驗中采用梯度稀釋法，設立同一樣品、相同稀釋度的菌懸液，不同倍數接種量條件下進行培養后觀察。與溫度和時間單因素實驗不同的是，為了更好地對接種量進行控制，本次實驗采用的是單獨批次的燕麥片成品稀釋液，采用的培養基是PCA培養基，測定的是菌落總數。所得結果見5表。由表5可知，不同初始接種量對燕麥優勢酵母菌株菌落總數影響力比例為n×1∶n×2∶n×3∶n×4≈1∶1.83∶3.83∶8.38。

3 燕麥菌落總數檢測新閾值的設立與驗證

綜上所述，燕麥優勢酵母菌最佳培養溫度為30℃，培養時間48h后仍然保持較旺生長，燕麥片成品檢測樣接種量與菌落總數結果接近倍數關系。以此為據，設定新的檢測閾，采用平板計數瓊脂培養基培養40h展開第1次觀測，而后繼續培養至48h，再觀察1次。記錄的都是菌落總數。與接種量單因素實驗同步展開驗證實驗，根據設立閾值，每個接種量分別設計5組平行實驗并觀測整理菌落總數結果均值。

檢測閾值設立方式如下：結合上述影響力比例數據，設定培養溫度36℃，培養時間40h，接種量為1倍，閾值300cfu;培養溫度36℃，培養時間40h，接種量為2倍，閾值550cfu;培養溫度36℃，培養時間40h，接種量為3倍，閾值1150cfu;培養時間40h，接種量為4倍，閾值2520cfu（這里的1倍接種量指的是25g燕麥片溶于225mL無菌生理鹽水，移液槍吸取1mL，接種在平板上，標記為10倍稀釋度的接種量，接種量若干倍就是通過上述基礎更改料液比進行濃縮，每次吸取1mL進行接種的量，下文同）。

驗證實驗結果為：培養溫度36℃，培養時間40h，接種量為1倍，40h結果均值270cfu，48h結果均值1500cfu;培養溫度36℃，培養時間40h，接種量為2倍，結果均值490cfu，48h結果均值2800cfu;培養溫度36℃，培養時間40h，接種量為3倍，結果均值980cfu，48h結果均值5400cfu;培養時間40h，接種量為4倍，結果均值1900cfu，48h結果均值9850cfu，均未超過設立的檢測閾值，也符合GB19640-2016規定的菌落總數測定項合格標準，新檢測閾值建立成功。

4 結論與討論

通過本實驗發現，在36℃，GB4789.2-2016規定的正常檢測接種量的培養條件下，檢測培養40h，如果菌落總數小于270cfu，則本次菌落總數項目檢測結果<10000cfu，食品安全符合國家標準規定。本實驗中，設立檢測閾值用的是針對燕麥優勢酵母菌株的選擇性培養基，而驗證檢測閾值的時候用的是平板計數瓊脂培養基，使結果更接近真實工作檢測流程發生的結果。通過鎖定優勢菌以及觀察其生長特性，從而給設定新檢測閾值打下基礎。此外，通過驗證實驗發現，高濃縮倍數的接種量并未帶來同比例的菌落總數增益效果，可能是由于燕麥成品中的β-葡聚糖的抗真菌作用[1-3]。因此，通過新檢測閾值的設立與驗證，可以為燕麥行業菌落總數項目檢測提供一定的參考依據。

參考文獻

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[3]申旺，葉麗燕，楊文麗，等.血漿（1，3）-β-D-葡聚糖在侵襲性真菌感染臨床診治中的應用評價[J].中華醫院感染學雜志，2018，28（09）：1288-129. （責編：張宏民）