輔助發酵菌株對發酵乳品質的影響

羅天淇，蔡 淼，張 敏，李曉琬，王世杰，朱 宏，楊貞耐,*

（1.北京工商大學，北京食品營養與人類健康高精尖創新中心，北京市食品添加劑工程技術研究中心，北京 100048；2.石家莊君樂寶乳業有限公司，河北 石家莊 050221）

酸乳是通過保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌共同發酵牛乳生產的一種發酵乳制品，憑借其高營養價值和獨特風味，深受廣大消費者的喜愛[1-2]。近些年來，隨著生活水平的提高，人們對于食品的營養和功能追求也越來越高[3]，為了改善酸乳的風味、質地、外觀等品質特性，增強酸乳的益生性，在常規酸乳發酵劑的基礎上添加其他乳酸菌進行發酵已經成為一種流行的做法。研究表明，不同菌株的加入能夠對發酵乳品質產生不同的影響。瑞士乳桿菌H9可以加快發酵乳的酸化和蛋白質水解，促進乙偶姻和苯甲醛的形成[4]。鼠李糖乳桿菌GG能夠顯著降低山羊乳酸乳中短鏈和中鏈脂肪酸的含量[5]。植物乳桿菌的加入能夠引起發酵乳質地（黏附性）和揮發性風味化合物組成（乙醛）的明顯變化[6]。產黏乳桿菌與傳統酸乳發酵劑共同發酵會延長酸乳的發酵時間，提高酸乳的黏度與保水性，改善酸乳口感[7]。

本研究使用7 株從傳統發酵乳制品中分離的常用乳酸菌作為輔助菌株，與常規酸乳發酵劑共同發酵，系統地研究比較這些菌株對發酵乳品質的影響，為進一步了解輔助發酵菌種的作用機制及功能性發酵乳產品研發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

全脂乳粉 新西蘭恒天然集團；發酵劑YO-MIX 300 LYO（保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌） 丹麥Danisco公司；輔助菌株：包括乳酸乳球菌乳脂亞種（Lactococcus lactissubsp.cremoris，Lcr）、乳酸乳球菌乳酸亞種（Lactococcus lactissubsp.lactis，Ll）、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei，Lca）、發酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum，Lf）、鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus，Lr）和2 株植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum，Lp1、Lp2） 本實驗室分離保藏。

1.2 儀器與設備

MLS-3781L-PC高壓蒸汽滅菌鍋 日本Sanyo公司；DHP-9032電熱恒溫培養箱 上海一恒科學儀器有限公司；iCinac乳品發酵監控儀 法國AMS Alliance公司；Rheolaser Master光學微流變儀 法國Formulaction公司；7890A-7000氣相色譜-質譜聯用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）儀美國Agilent公司；CR 21G Ⅲ高速冷凍離心機 日本Hitachi公司；Brookfield CT3質構儀 美國Brookfield公司；FE28數顯pH計 Mettler-Toledo儀器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 發酵乳的制備

使用全脂乳粉制備質量濃度12 g/100 mL的全脂復原乳，65 ℃條件下殺菌30 min，冷卻至室溫，接菌后37 ℃發酵至pH值為4.5，快速冷卻并攪拌后置于4 ℃貯藏。其中，對照組（D）只加入商品發酵劑YO-MIX 300 LYO，實驗組（D-Lr、D-Lf、D-Lca、D-Lp1、D-Lp2、D-Lcr、D-Ll）添加輔助菌株和商品發酵劑（1∶1），接菌量均為107CFU/mL。

1.3.2 發酵乳pH值、氧化還原電位的測定

采用iCinac乳品發酵監控儀對發酵過程中pH值、氧化還原電位的變化進行實時監測，每1 min記錄1 次。采用pH計記錄發酵乳貯藏期間的pH值變化。

1.3.3 發酵乳中活菌數的測定

參照GB 4789.35—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 乳酸菌檢驗》測定發酵乳中乳酸菌的總菌數。

1.3.4 發酵乳微流變學參數測定

取接菌后的牛乳20 mL至微流變儀專用樣品池中，將樣品池插入微流變儀，運行實時測試程序。在37 ℃條件下實時監測發酵凝膠過程中的宏觀黏度指數（micro viscosity index，MVI）、彈性指數（elasticity index，EI）及流動性指數（fluidity index，FI）隨時間的變化情況，直至發酵乳pH值降至4.5，每隔3 min采集1 次數據。然后將樣品放置于4 ℃冷藏21 d，定期取樣，檢測發酵乳微流變學參數的變化。

1.3.5 發酵乳持水力測定與質構分析

各組均準確稱量10 g發酵乳樣品，分別放于標號的離心管中并稱質量，放入離心機中4 000 r/min離心20 min，去上清液，稱質量。持水力按照下式計算。

式中：m0為空離心管質量/g；m1為離心管加樣品的質量/g；m2為樣品離心除去上清液后的離心管加樣品質量/g。

參考龐志花等[8]的方法，使用Brookfield CT3質構儀進行質地剖面分析（texture profile analysis，TPA），選用圓柱形TA10探頭，目標值10.0 mm，測試速率0.5 mm/s。測定參數包括硬度、內聚性和膠著性。

1.3.6 發酵乳揮發性風味物質測定

固相微萃?。╯olid phase micro-extraction，SPME）法提取揮發性風味物質：萃取前將SPME纖維置于GC-MS進樣口老化。取10 g發酵乳樣品和1 μL內標物2-甲基-3-庚酮于30 mL萃取瓶中，內標物質量濃度為0.816 μg/μL，加蓋密封，在40 ℃恒溫水浴中平衡30 min后，將SPME萃取纖維通過瓶蓋插入樣品中的頂空部分，推出纖維，頂空吸附30 min后拔出；快速插入GC-MS進樣口解吸5 min，進行GC-MS分析。

GC條件：采用DB-wax色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）進行分析。升溫程序：起始柱溫40 ℃，保持3 min，以5 ℃/min升溫至200 ℃，以10 ℃/min升至230 ℃，保持3 min，載氣為氦氣，流速1.2 mL/min，不分流進樣。

MS條件：電子電離源，電子能量70 eV，傳輸線溫度280 ℃，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，質量掃描范圍40～250（m/z）。

定性分析：化合物通過NIST 14質譜數據庫和文獻報道的保留指數（retention index，RI）來鑒定。

定量分析：使用2-甲基-3庚酮為內標物，采用內標法進行定量分析，求得各揮發性成分的含量。

1.4 數據處理

每個樣品至少測定3 次，實驗數據采用SPSS 17.0軟件進行分析，P＜0.05表示差異顯著，使用Sigma Plot軟件作圖，風味物質用NIST 14譜庫檢索，并應用Canoco 4.5統計分析軟件對風味數據進行主成分分析。

2 結果與分析

2.1 發酵乳pH值、氧化還原電位與活菌數變化

圖1 發酵過程中發酵乳pH值的變化Fig. 1 Changes in pH value of fermented milk during fermentation

由圖1可知，各組發酵乳的發酵pH值曲線變化相同，呈現先下降后趨于平穩的趨勢，但到達發酵終點（pH=4.5）的時間存在一定差異，分別為407（D）、368（D-Lr）、351（D-Lf）、337（D-Lca）、340（D-Lp1）、376（D-Lp2）、386（D-Lcr）、376 min（D-Ll），說明輔助菌株的加入能夠不同程度地縮短發酵時間，如Lca、Lp1能顯著加快牛乳發酵，而Lcr則影響較小，這一差異可能與輔助菌株和常規酸乳發酵劑之間的相互作用有關。

圖2 發酵過程中發酵乳氧化還原電位的變化Fig. 2 Changes in oxidation-reduction potential of fermented milk during fermentation

氧化還原電位是乳酸菌的基本物理化學性質之一，氧化性強，氧化還原電位值較高；還原性強，氧化還原電位值較低[9]。由圖2可知，各組發酵乳的氧化還原電位均呈先下降后緩慢提升的趨勢，其中D、D-Lp1組變化最小，而添加乳酸乳球菌的D-Ll、D-Lcr組發酵乳氧化還原電位變化最大。Morandi等[10]研究709 株乳酸菌的還原活性后指出，糞腸球菌和乳酸乳球菌是還原活性最高的菌種，而嗜熱鏈球菌的還原活性最低，與本研究結果基本吻合。

圖3 4 ℃冷藏過程中發酵乳pH值的變化Fig. 3 Changes in pH value of fermented milk during 4 ℃ storage

圖4 4 ℃冷藏過程中發酵乳活菌數的變化Fig. 4 Changes in viable cell count of fermented milk during 4 ℃ storage

由圖3～4可知，整體上冷藏期間發酵乳的pH值呈現出先快速下降后趨于穩定的趨勢，但各組樣品pH值存在一定差異，其中D-Ll和D-Lcr組pH值高于對照組，而D-Lp1、D-Lp2、D-Lca、D-Lf、D-Lr組pH值明顯較低，說明這些輔助菌株的加入會影響發酵乳的后酸化過程。而各組發酵乳的活菌數在冷藏期間先升高后降低，同時對照組中的活菌數相對較低。

2.2 發酵乳發酵過程與冷藏期間的微流變學變化

微流變儀能夠通過監測樣品中粒子的運動，在不破壞樣品的前提下研究樣品流變特性[11]。由圖5～10可知，各組發酵乳的EI、MVI和FI變化趨勢相同，但是各組發酵乳的這些流變學特性之間存在一定差異。

圖5 發酵乳發酵過程中EI的變化Fig. 5 Changes in EI of fermented milk during fermentation

圖6 4 ℃冷藏過程中發酵乳EI的變化Fig. 6 Changes in EI of fermented milk during 4 ℃ storage

圖7 發酵乳發酵過程中MVI的變化Fig. 7 Changes in MVI of fermented milk during fermentation

圖8 4 ℃冷藏過程中發酵乳MVI的變化Fig. 8 Changes in MVI of fermented milk during 4 ℃ storage

圖9 發酵乳發酵過程中FI的變化Fig. 9 Changes in FI of fermented milk during fermentation

圖10 4 ℃冷藏過程中發酵乳FI的變化Fig. 10 Changes in FI of fermented milk during 4 ℃ storage

凝膠EI、MVI、FI的變化可以分別表征發酵乳的彈性、黏性及流動性，EI、MVI越大，樣品的黏彈性越強，而FI越大則樣品流動性越強。結合圖1的發酵pH值曲線可知，在發酵過程中（圖5、7、9），發酵乳的EI、MVI、FI變化可以分為3 個階段。在發酵前期，發酵乳pH值由起始值降至5.3左右，樣品處于相對穩定的低黏度、低彈性、高流動性狀態；當pH值進入5.3～5.0這一范圍內時，發酵乳黏度、彈性快速增加，而流動性快速下降，這與酪蛋白引起的凝膠化有關[12]；之后，發酵乳初步形成較為穩定的凝膠結構，黏性、彈性、流動性變化減緩，進入高黏彈性、低流動性階段。發酵結束時，與其他組相比，對照組的MVI最低，EI和FI最高。4 ℃貯藏時（圖6、8、10），由于溫度的降低及攪拌的影響，發酵乳的MVI、EI在第1天出現一定程度的降低，FI升高。隨后，各組發酵乳的MVI、EI逐漸降低，FI逐漸升高，流動性不斷增強，這可能與后酸化引起的凝膠結構不穩定有關。其中，D-Lp1組發酵乳的MVI、EI最高，FI最低，具有良好的穩定性，結合實驗室前期實驗結果，推測可能與Lp1高產胞外多糖、促進凝膠結構穩定的特性有關[13]。

2.3 發酵乳冷藏期間持水力及質構特性變化

表1 發酵乳4 ℃冷藏期間的持水力和質構特性變化Table 1 Changes in water-holding capacity and texture of fermented milk during 4 ℃ storage

持水力是發酵乳品質高低的重要指標之一，它對延長發酵乳產品的貨架期起著關鍵性作用。由表1可知，冷藏期間各組發酵乳的持水力整體上呈先升高后下降的趨勢，同時實驗所用輔助菌株的加入均能在一定程度上提高發酵乳的持水性能，有利于發酵乳凝膠結構的穩定性。

TPA可以模擬人類咀嚼食品，目前被廣泛應用于固體、半固體食品的質構分析中[14]。內聚性能夠反映樣品內部分子間或各結構要素間結合作用的強弱，內聚性越大，結合作用越強[15]，而膠著性反映使半固態樣品破裂成吞咽時的分散狀態所需的能量。TPA結果表明，Lf能夠有效提高發酵乳的硬度，Lr、Lf、Lp1對發酵乳的內聚性、膠著性有增強作用。因此Lr、Lf、Lp1這3 株輔助菌株對發酵乳結構的穩定性具有積極作用。

2.4 發酵乳的風味物質分析

2.4.1 SPME-GC-MS檢測結果

表2 發酵乳揮發性組分的定性及定量分析結果Table 2 Qualitative and quantitative analysis results of volatile compounds in fermented milk

由表2可知，經過SPME萃取，GC-MS檢測分析后，從8 組酸乳樣品中共檢出揮發性物質33 種，包括烴類5 種、醇類2 種、醛類6 種、酮類9 種、酯類2 種、酸類8 種、其他化合物1 種。由于8 組樣品發酵使用菌株的不同，造成發酵乳中揮發性風味物質組成、含量上的差異，形成不同的風味。

在風味研究中，烯烴和芳香烴類物質閾值較低，且具有特殊香氣，對產品風味貢獻較大；而烷烴類物質閾值較高，通常對樣品風味的貢獻不大。在檢測出的5 種烴類物質中，甲苯具有水果甜味，苯乙烯能賦予食品甜味和花香味[16]，萘具有類似樟腦丸的氣味。通常認為在發酵乳制品中，烴類物質大多來源于原料乳自身，但由表2可知，加入不同發酵菌株后各組發酵乳樣品的烴類物質含量存在顯著差異（P＜0.05），說明發酵乳中的烴類物質受發酵菌株的影響。

在8 組發酵乳樣品中僅檢出己醇和庚醇2 種醇類揮發性物質，且含量較低，其來源可能與甲基酮類物質的還原有關[17]。其中，己醇具有樹脂和花的香味，在常規發酵劑發酵的D組酸乳中含量較低，而在分別添加發酵乳桿菌、乳酸乳球菌的D-Lf、D-Lcr、D-Ll 3 組樣品中沒有檢出。同時郝曉娜等[18]發現，在乳酸乳球菌發酵制作干酪的過程中添加植物乳桿菌，可以額外產生己醇等風味物質，說明己醇在發酵乳中的產生可能具有菌株特異性。

醛類揮發性物質是發酵乳風味的重要組成部分，通常其風味閾值較低，但由于醛類化合物化學性質比較活潑，易發生還原反應，因此這類化合物在發酵乳制品中的含量通常都不高，在本研究8 組酸乳樣品中的含量為2%～8%。在這些醛類物質中，壬醛帶有鮮花、柑橘和脂肪的香氣，但是含量超過某個閾值時會產生令人不愉快的氣味[19]；苯甲醛具有杏仁香，可以通過色氨酸降解生成；反式-2-壬醛有類似黃瓜、脂肪的香氣。此外，反-2-辛烯醛只在D-Lca組檢出，糠醛只在D-Ll組檢出，癸醛只在D-Lf組檢出，它們分別能賦予發酵乳堅果、鮮花、橙皮與牛油氣味，這些特異性物質的存在可能能夠參與益生菌發酵乳特征風味的形成。

酮類化合物是發酵乳中一類重要的風味物質，在各組樣品中的含量為26%～40%。通常認為發酵乳中的酮類物質可以通過脂肪酸氧化、熱降解、氨基酸降解和微生物代謝等多種途徑形成，并且隨著碳鏈的增長香氣更加濃郁。在這些酮類物質中，2,3-丁二酮（雙乙酰）、3-羥基-2-丁酮（乙偶姻）是乳酸菌代謝乳糖的產物，同時也是酸乳中極其重要的風味物質。雙乙酰具有濃郁的奶油香味，相關研究表明，當酸乳中乙醛含量較低時，雙乙酰能賦予酸乳獨特的風味[20]。而乙偶姻是雙乙酰的還原形式，和雙乙酰一樣有奶油香味，但香味遠弱于雙乙酰[21]。D-Lf、D-Lcr組中沒有雙乙酰檢出，D-Lf、D-Lcr、D-Ll組中沒有乙偶姻檢出，說明這3 株菌對雙乙酰、乙偶姻的生成存在抑制作用，可能與菌株間對相關底物的競爭作用及代謝通路有關。此外，2-庚酮、2-辛酮、2-壬酮、2-十一酮及2-十三烷酮等甲基酮來源于飽和脂肪酸的氧化水解[22]，能夠賦予發酵乳濃郁的香氣，3-己酮具有葡萄香氣。

酸類揮發性物質是發酵乳風味物質中的主要組成部分，在8 組樣品中其含量分別為40.21%、50.77%、51.52%、45.07%、45.27%、55.86%、53.65%和44.77%，同時除了Lca、Lp1以外，其他5 株菌的加入均能有效提高發酵乳中的揮發性脂肪酸含量，并且添加乳酸乳球菌乳脂亞種的D-Lcr組酸乳的酸類物質含量顯著高于其他組（P＜0.05），與李良[23]關于乳酸乳球菌LL單獨發酵可以提高稀奶油中脂肪酸和甲基酮含量的研究結果相似。通常認為，在發酵乳制品中酸類物質對整體風味的貢獻主要表現在滋味上，但對氣味也有一定影響。潘國卿等[24]認為，發酵乳制品中的短鏈脂肪酸是發酵乳奶油香味的主要組成成分。這些酸類物質中，乙酸具有醋酸味，丁酸、庚酸具有奶油味，己酸、癸酸具有油脂味，辛酸有微弱的水果酸氣味。

酯類主要是通過脂肪酸水解、微生物代謝2 種途徑產生，γ-丁內酯具有牛乳、奶油氣味[25]，乙酸壬酯具有香甜的水果氣味。而二甲基砜具有硫磺氣味，可能與原料乳殺菌時的美拉德反應及氨基酸降解有關。2.4.2 發酵乳風味物質組成的主成分分析

圖11 發酵乳風味物質組成的主成分分析Fig. 11 Principal component analysis of fermented milk flavor compounds

為明確不同菌株與常規酸乳發酵劑復配對發酵乳風味的影響，利用主成分分析法考察揮發性風味物質與樣品間的分布關系。由圖11可知，F1和F2的貢獻率分別為50.8%、21.0%，可以很好地解釋不同菌株組合對酸乳風味的影響。各組樣品在主成分分析圖中的分布比較分散，說明不同菌株的加入使得常規發酵劑發酵酸乳的揮發性風味物質組成發生明顯變化。

D-Lr、D-Lp1和D-Lp2 3 組發酵乳與D組發酵乳距離較近，僅在F2上存在一定差異，說明其對發酵乳風味的影響較小，可能與鼠李糖乳桿菌及植物乳桿菌在牛乳中生長較慢、在發酵過程中對發酵乳風味的貢獻有限有關[26]，造成這幾組發酵乳風味差異的主要風味物質包括己醇（6）、2,3-丁二酮（14）和3-羥基-2-丁酮（18）。在這3 種物質的基礎上，庚醇（7）、苯甲醛（12）和2-十三烷酮（22）引起D、D-Lca 2 組間的風味差異。而D-Lf、D-Ll組與D組在F1上存在顯著差異，D-Lcr組與D組更是在F1、F2上均存在明顯差異，同時乙酸（23）等酸類物質對這些差異的產生有較大貢獻，說明Lf、Ll、Lcr這3 株菌與常規酸乳發酵劑共同發酵主要通過促進脂肪酸類揮發性物質的形成影響發酵乳的整體風味，并且對牛乳發酵過程中風味的形成有較大影響。

3 結 論

通過使用7 株不同的乳酸菌與常規酸乳發酵劑共同發酵，研究這些菌株輔助發酵時對發酵乳品質的影響。結果表明：輔助菌株的加入能夠在不同程度上加快發酵過程中的產酸速率，與對照組相比可以縮短5.15%～17.20%的發酵時間，乳酸乳球菌Lcr、Ll在發酵過程中還會引起氧化還原電位的顯著變化，同時發酵乳在冷藏期間的pH值也會受到影響；微流變學研究結果顯示，在發酵過程中輔助菌株能夠提高發酵乳的黏性，并降低彈性和流動性，而植物乳桿菌Lp1能夠使發酵乳在貯藏期間具有高黏彈性及低流動性；這些菌株均能提高發酵乳的持水力，Lr、Lf、Lp1對發酵乳的內聚性、膠著性有增強作用；GC-MS和主成分分析結果顯示，Lr、Lp1、Lp2對發酵乳風味影響較小，而Lca能夠增加發酵乳中庚醇、苯甲醛、2-十三烷酮的含量，Lf、Ll、Lcr的加入會促進發酵乳中短鏈、中鏈脂肪酸等風味物質的形成。本研究結果揭示了不同輔助發酵菌株對酸乳發酵特性、微流變、質構和風味的影響，結果為高品質功能性發酵乳研發提供了參考。