超高效液相色譜-串聯質譜法測定乳及乳制品中水楊酸的含量

胡 雪，張 悅，張立佳，莫 楠，段國霞，劉麗君，李翠枝*

（內蒙古伊利實業集團股份有限公司，內蒙古 呼和浩特 010110）

水楊酸是植物自身合成的一種天然小分子酚類化合物，主要調控植物的生長發育及果實成熟，并且作為植物的內源信號分子在抗逆反應中起關鍵作用[1]。水楊酸具有防腐、殺菌等作用，作為重要原料被廣泛用于醫藥[2-3]、護膚品[4]、防腐劑[5]等領域，美國食品藥品管理局、美國皮膚病學會規定，水楊酸作為非處方藥使用的最高限量為2.0%；歐盟化妝品法規（EC）No.1223/2009附錄V第3條款規定，水楊酸作為防腐劑的最大允許使用量為0.5%，作為非防腐劑，在淋洗類發用產品中的最大允許使用量為3.0%，在其他產品中的最大允許使用量為2.0%；中國國家食品藥品質量監督管理局也規定，護膚品中水楊酸最高限量為2.0%。但我國在食品加工生產中禁止使用水楊酸，水楊酸為禁用食品添加劑，這是由于過敏體質人群食用水楊酸含量較高的食品后，會刺激食道和消化道黏膜，產生酸中毒癥狀，副作用嚴重，擾亂人體消化機能。調查顯示，2.5%的歐洲人可能對水楊酸鹽有過敏反應[6-7]。但是，水楊酸作為植物激素廣泛存在于植物源性食品中，如蔬菜、水果、香草和香料等[8]。Morgan[9]認為，水果和蔬菜中存在的低含量天然水楊酸鹽對人體有益。天然來源的水楊酸和人為添加的水楊酸的含量總和一旦超過一定范圍就會引起過敏人群的過敏反應，而我國對食品中水楊酸含量的檢測尚未出臺相關的食品安全國家標準。食品行業迫切需要開發一種快速、通用、高效的檢測方法，以便準確、及時地測定食品中水楊酸的含量。

目前，食品中水楊酸的測定方法有分光光度法[10]、高效液相色譜法[11-12]、氣相色譜-質譜法[13-14]和液相色譜-質譜聯用法[14]等，其中液相色譜-質譜聯用法的靈敏度及特異性強，適合低含量檢測。本研究聚焦于乳制品中水楊酸的含量測定，采用酸化乙腈溶劑提取，HLB柱凈化，建立快速、準確的超高效液相色譜-串聯質譜（ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）法，同時檢測牛乳、酸乳、乳粉及冷凍飲品中水楊酸的含量。為企業風險控制提供科學依據，為國家標準的出臺提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

標準物質：水楊酸（純度99%） 捷世康生物科技有限公司；乙腈（色譜純） 德國Meker公司；甲醇（色譜純） 美國Fisher公司；磷酸（純度＞99%）上海安譜實驗科技股份有限公司；甲酸（色譜純）沃爾孚科技發展有限公司。

1.2 儀器與設備

超高效液相色譜-質譜聯用儀（配備電噴霧離子源）、Oasis HLB固相萃取柱（60 mg/3 mL） 美國Waters公司；3K30低溫高速離心機 德國Sigma公司；KS 501渦旋混合振蕩器 德國IKA公司；10430 Harris Oaks氮吹儀 瑞典Biotage公司；固相萃取裝置 美國Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

1.3.1.1 提取

稱取試樣2.0 g（乳粉樣品稱取0.5 g），放置于30 mL離心管中，加入5 mL水溶解試樣，渦旋混勻；準確加入10 mL酸化乙腈（體積分數1%），渦旋混勻1 min，振蕩提取10 min；加入2 g氯化鈉，再振蕩提取10 min，4 ℃條件下12 000 r/min離心10 min；分層后準確移取5 mL上清液于試管中，40 ℃氮吹至近干；加入0.2 mL甲醇復溶，渦旋混勻1 min，然后加入5 mL磷酸水溶液（0.02 mol/L），渦旋混勻30 s，超聲波水浴助溶5 min，待凈化。

1.3.1.2 凈化

選用Oasis HLB固相萃取柱（60 mg/3 mL），依次用3 mL甲醇、3 mL水、3 mL 0.02 mol/L磷酸水溶液活化和平衡固相萃取柱，試管中液體全部上樣，用0.02 mol/L磷酸水溶液潤洗試管3 遍，每次渦旋30 s（每次1 mL），全部轉移至固相萃取柱，待凈化液流干后，先用3 mL磷酸水溶液（0.02 mol/L）淋洗固相萃取柱，棄去，再用3 mL水淋洗，棄去，最后用5 mL甲醇分2 次洗脫，收集洗脫液于10 mL專用氮吹試管中，洗脫液在40 ℃條件下氮氣吹干，加入1 mL 20%甲醇水溶液復溶，過0.22 μm微孔濾膜后，供UPLC-MS/MS測定。

1.3.1.3 標準曲線的繪制

將質量濃度為100 ng/mL的標準中間溶液用20%甲醇水溶液稀釋，稀釋后質量濃度分別為0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 ng/mL，繪制標準曲線。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：Acquity UPLC BEH C18柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱溫35 ℃；進樣量10 μL；流動相A為0.1%甲酸水溶液，流動相B為乙腈；流速300 μL/min；線性梯度洗脫條件如表1所示。

表1 梯度洗脫條件Table 1 Procedure of gradient elution

1.3.3 質譜條件

電離模式：電噴霧離子源負離子模式；毛細管電壓3.5 kV；源溫110 ℃；脫溶劑溫度350 ℃；脫溶劑氣流量650 L/Hr；碰撞室氣流量0.18 mL/min；多反應監測模式檢測；其他質譜條件如表2所示。

表2 水楊酸的質譜測定條件Table 2 MS/MS conditions for salicylic acid

1.3.4 結果計算

試樣中水楊酸的含量按下式計算。

式中：X為試樣中水楊酸殘留量/（μg/kg）；ρ為試樣上機溶液中水楊酸殘留量/（ng/mL）；V為樣液最終定容體積/mL；n為稀釋倍數；m為試樣質量/g。

2 結果與分析

2.1 樣品前處理條件優化

2.1.1 復溶溶劑的選擇

比較磷酸-甲醇水溶液（8∶2，V/V）、20%甲醇水溶液、0.02 mol/L磷酸水溶液、0.02 mol/L鹽酸水溶液和0.02 mol/L乙酸水溶液作為復溶溶劑的上柱洗脫效果，結果表明，0.02 mol/L磷酸水溶液洗脫效果最佳，回收率在85%左右，其他幾種復溶溶劑的效果無明顯差異，回收率均為70%～75%。水楊酸具有較強的酸性，磷酸-甲醇水溶液（8∶2，V/V）和20%甲醇水溶液無法將水楊酸完全復溶。此外，由于水楊酸微溶于水，磷酸增加其在水中溶解度的效果優于鹽酸和乙酸。綜上所述，本研究選擇0.02 mol/L磷酸水溶液作為復溶溶劑。

2.1.2 凈化方法的選擇

分別選擇Oasis MAX柱、Oasis HLB柱、Sep-Pak C18柱3 種凈化柱，需要預先依次用3 mL甲醇、3 mL水、3 mL 0.02 mol/L磷酸水溶液活化和平衡固相萃取柱，直接對水楊酸加標量為20 μg/kg的空白樣品提取液進行凈化，外標法定量，比較回收率。結果表明：MAX小柱為混合型強陰離子交換柱，同時具有陰離子交換和反相保留能力，水楊酸在酸性條件下離子化被抑制，以分子狀態存在，無法被吸附劑完全保留，回收率幾乎為零；C18小柱效果一般，凈化時間較長，回收率小于40%；HLB柱凈化效果最好，回收率集中在80%～90%，整體在60%～120%范圍內，滿足方法要求，最終選擇Oasis HLB柱作為凈化柱。水楊酸的總離子流色譜圖如圖1所示。

圖1 水楊酸的總離子流色譜圖Fig. 1 Total ion current chromatogram for salicylic acid

2.2 標準曲線和定量限

表3 水楊酸的線性范圍、線性方程、相關系數和定量限Table 3 Linear ranges, linear equations, correlation coefficients and limits of quantitation of salicylic acid in milk and milk powder

按照1.3.2節的色譜條件，采用外標曲線定量法，以目標物的峰面積（y）對相應的質量濃度（x）作標準曲線。由表3可知，水楊酸質量濃度范圍為0.5～50.0 μg/L時線性關系良好，標準曲線相關系數均大于0.999，方法對牛乳及乳粉中水楊酸的定量限分別為5.0、10.0 μg/kg，可以滿足定量分析的需要。

2.3 方法回收率和精密度

表4 水楊酸測定回收率與相對標準偏差Table 4 Recovery and RSD

在陰性樣品中添加5～40 μg/kg的水楊酸，各添加水平均做6 次平行實驗，計算回收率和精密度。本研究測定定量限、2 倍定量限、4 倍定量限3 個不同添加量時的加標回收率。由表4可知，回收率范圍為68.3%～111.7%，相對標準偏差范圍為3.3%～15.2%，除乳粉基質加標回收率相對標準偏差大于10%以外，其余均小于10%。由于乳粉基質比酸乳、牛乳基質更復雜，基質干擾大，對定量限、2 倍定量限的相對標準偏差影響較大，但回收率在68.3%～111.7%之間，滿足方法要求。以上數據說明，該方法具有較好的回收率和精密度。

2.4 實際樣品檢測

利用本研究建立的前處理和色譜、質譜條件對市場上銷售的20 批次乳粉、20 批次牛乳、20 批次酸乳及20 批次雪糕中水楊酸的含量進行檢測。結果表明，乳粉、牛乳、雪糕和原味酸乳中水楊酸均為未檢出，與K?szycka[8]、Swain[15]等的市場調查發現牛乳及原味酸乳中無水楊酸檢出結果一致。而不同口味的酸乳中水楊酸含量有明顯差異，草莓、黃桃、芒果和藍莓口味的酸乳中均檢測到水楊酸，添加草莓的酸乳中水楊酸含量略高，這與Scotter等[13]測得的草莓酸乳中水楊酸含量約為200 μg/kg結果相似，說明酸乳中添加的水果種類是造成水楊酸含量有所差異的主要原因。

3 結 論

采用UPLC-MS/MS同時測定牛乳、乳粉、酸乳及冷凍飲品中水楊酸的含量。該方法在水楊酸質量濃度0.5～50.0 ng/mL范圍內具有良好的線性相關性，牛乳和乳粉中水楊酸的定量限分別為5.0、10.0 μg/kg，加標回收率在68.3%～111.7%之間，相對標準偏差在3.3%～15.2%之間。本方法簡便、快速、回收率高、重現性好。本研究表明，不同水果口味的酸乳，天然水楊酸的含量低且差異很大，已有研究表明，果蔬中天然存在的水楊酸鹽有利于人體健康，且果蔬中的少量水楊酸并不會引起過敏人群的強烈反應[6-7]。但水楊酸作為防腐劑、抑菌劑等添加劑添加到果蔬中會造成水楊酸含量升高，極有可能引起過敏人群的過敏反應。通過該方法可以準確、及時地測定食品中水楊酸的含量，為食品安全提供保障。