牦牛乳清粉的功能特性

高瑞平，梁 琪*，白莉莉，石永祺

（甘肅農業大學食品科學與工程學院，甘肅省功能乳品工程實驗室，甘肅 蘭州 730070）

目前，全球乳制品加工排放的乳清液總產量約為（180～190）×106t/年，僅有約50%的乳清液被處理和使用，其中，被處理的乳清液中僅有30%用于生產乳清粉[1]。根據生產工藝[2]，乳清液通常分為甜乳清液、酸乳清液、咸乳清液和原乳清液。原乳清液是調節牛乳pH值至4.6，分離酪蛋白沉淀后剩余的液體部分；然而，乳品工業中最普遍的是甜乳清液，它來源于酶凝型干酪生產過程的副產物，是國際上乳清液產量最大的一種。將乳清液濃縮、干燥制成的粉末狀產品稱之為乳清粉（whey powder，WP）。牦牛乳原乳清液和甜乳清液干燥之后的產品分別稱為牦牛原乳清粉（native yak whey powder，NYW）和牦牛甜乳清粉（sweet yak whey powder，SYW）。乳清粉總蛋白含量一般為11%～24%，乳糖含量小于60%，乳清粉中的乳清蛋白占牛乳總蛋白質的0.7%，含有20 種氨基酸，在營養學上被稱為“蛋白之王”[3]。

牦牛乳作為我國青藏高原地區特有的優質乳源，蛋白質含量（4.0%～5.9%）高于荷斯坦牛乳蛋白含量（2.3%～4.4%）[4]。近年來，牦牛乳產量已增加至4 000 萬t[5]，約25%通過現代加工業生產[6]。國際上，荷斯坦牛乳加工干酪、酸乳、酪蛋白及乳粉等產品是形成乳清廢液的來源，隨著牦牛乳品企業的建立和加工量的增大，對牦牛乳清液的回收利用有利于降低生產成本，提高牦牛乳品企業的經濟效益。目前，國內外市場銷售的乳清產品主要是來源于荷斯坦牛乳的乳清粉，牦牛乳清產品在國內外市場較為缺乏。學者們通過對荷斯坦乳清粉的化學組成和形態等理化指標的研究確定乳清粉的質量特性[7]。Banavara等[8]研究甜乳清粉的pH值、蛋白質含量、濁度、顏色和粒度分布等物理特性及溶解性、起泡特性等功能特性，發現起泡性能受甜乳清粉粒徑、亮度值影響較大，蛋白質含量影響溶解性。

本研究采用酸沉淀和酶凝方式分別制取SYW和NYW，通過對總蛋白質、乳糖、灰分含量和pH值等指標進行分析，同時對溶解性、持水性、持油性、起泡性、乳化性和熱穩定性等功能性質進行研究，以期系統揭示牦牛乳清粉的功能性質，為牦牛乳清粉加工產業和市場化應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮牦牛乳采自甘肅天?？h抓喜秀龍鄉牧民家中；NYW為新鮮牦牛乳脫脂、酸沉淀分離酪蛋白制取的乳清液真空冷凍干燥之后得到；SYW為甘肅省功能乳品工程實驗室牦牛乳硬質干酪制作過程中收集的甜乳清液直接真空冷凍干燥制??；進口荷斯坦乳清粉（Holstein whey powder，HW）為市售；所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

AL204電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；SP-723紫外-可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司；PHS-3C pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司；SH220N石墨消解儀 濟南海能儀器有限公司；SKD-200凱氏定氮儀 上海沛歐分析儀器有限公司；SCIENTZ-10ND冷凍干燥機、XHF-D高速分散器 寧波新芝生物科技股份有限公司；QL-866旋渦混合器 江蘇省海門市其林貝爾儀器制造有限公司；L500醫用離心機長沙湘儀離心機儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

NYW的制備：牦牛酸乳清液由鮮牦牛乳10 000 r/min離心30 min脫脂，調節pH值至4.6進行等電點沉淀，3 500 r/min離心20 min，收集上清液，真空冷凍干燥制得。

SYW的制備：實驗室硬質干酪制作過程中收集乳清廢液，真空冷凍干燥制得。

1.3.2 牦牛乳清粉主要組成測定

蛋白質總量測定：參考GB 5009.5—2016《食品安全國家標準 食品中蛋白質的測定》中的凱氏定氮法；乳糖含量測定：參考SNT 0871—2012《出口乳及乳制品中乳糖的測定方法》中的分光光度計法；灰分含量測定：參考GB 5009.4—2016《食品安全國家標準 食品中灰分的測定》；乳清粉溶液酸度采用pH計法進行測定。

1.3.3 牦牛乳清粉功能指標測定

1.3.3.1 溶解性的測定

配制質量濃度5 g/100 mL的牦牛乳清粉溶液，25 ℃恒溫振蕩1 h，10 000 r/min離心5 min，取上清液。用凱氏定氮法測上清液的蛋白質含量，每個樣品重復實驗3 次，溶解性按照公式（1）計算[9]。

式中：C1為上清液中蛋白質含量/（g/100 g）；C為樣品中蛋白質含量/（g/100 g）。

1.3.3.2 持水性和持油性的測定[10]

持水性：用預先稱質量后的離心管準確稱取2.0 g樣品，緩慢加水，每加幾滴水，就用旋渦混合器混合幾分鐘，直至樣品呈漿狀且無水析出時為止；于10 000 r/min離心3 min，倒去上層清液，稱質量；離心后若無上清液，再加水攪勻離心，直至離心后有少量上清液為止。持水率按照公式（2）計算。

式中：m1為空試管的質量/g；m2為試管加樣品的質量/g；m3為沉淀物加試管的質量/g。

持油性：將1 g（精確到0.001 g）樣品溶于含25 mL大豆色拉油的離心管，用旋渦混合器混合30 s；油混合物在4 200 r/min的條件下離心分離30 min，測定分離出的油體積。持油率以每克蛋白質樣品吸收油的毫升數表示，按照公式（3）計算。

式中：V0為25 mL；V1為離心分離出油的體積/mL；m為樣品質量/g。

1.3.3.3 起泡性的測定

取40 mL 2 g/100 mL的牦牛乳清粉溶液，用內切式高速分散器10 000 r/min攪打1 min，快速將泡沫轉移至量筒中，測量攪打后的泡沫體積和靜止10 min時的泡沫體積。起泡能力用經攪打后蛋白質分散物的體積增加量表示，起泡能力和泡沫穩定性分別按照公式（4）～（5）計算[11]。

式中：V0為攪打后泡沫的體積/mL；V10為放置10 min后的泡沫體積/mL；V為攪打前樣品溶液的體積/mL。

1.3.3.4 乳化性的測定

取2 g/100 mL的牦牛乳清粉溶液21 mL，邊攪拌邊加入純大豆色拉油9 mL，然后以10 000 r/min的速度高速勻漿1 min制成乳狀液；乳狀液放置10 min時小心地從玻璃容器底部取100 μL乳化液加入到5 mL、0.1%十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）溶液中，混勻，利用紫外-可見分光光度計于500 nm波長處測量其吸光度，用0.1%的SDS溶液為空白調零。采用乳化活性指數（emulsifying activity index，EAI）及乳化穩定性指數（emulsifying stability index，ESI）來表示乳化特性。EAI是指在乳化體系中每克蛋白質所產生的界面面積的大小，ESI是指蛋白質持油水混合不分離的乳化特性對外界條件的抗應變能力。EAI和ESI分別按照公式（6）～（7）計算[12]。

式中：ρ為樣品溶液質量濃度（2 g/100 mL）；φ為油相所占的體積分數（2%）；A500nm為500 nm波長處的吸光度；n為樣品稀釋倍數；A0為0時刻的吸光度；A10為10 min后的吸光度。

1.3.3.5 熱穩定性的測定

測定依據是熱處理時蛋白質在溶液中的溶解程度。將2 g/100 mL的牦牛乳清粉溶液分別在60、65、70、75、80、85、90、95 ℃水浴中加熱30 min；取出后立即冰浴2 min，恢復至室溫；然后稱取熱處理后的溶液于2 500 r/min離心10 min，倒出上層溶液，稱取下層沉淀物質量，按照公式（8）計算沉淀率[13]。沉淀率越大，穩定性越差。

式中：m1為下層沉淀物質量/g；m為溶液中總蛋白量/g。

1.4 數據處理

實驗數據采用Excel軟件統計，Origin 2018軟件作圖，最終實驗結果應用SPSS 19.0軟件中的單因素方差分析（ANOVA）進行顯著性分析，以P＜0.05具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 牦牛乳清粉主要成分分析

表1 牦牛乳清粉的主要成分Table 1 Main components of yak whey powder

由表1可知，NYW和SYW的總蛋白質含量存在顯著差異（P＜0.05），SYW的總蛋白質含量為17.323%，比NYW高出3.433%，Alsaed等[14]研究發現，荷斯坦原乳清液總蛋白質含量和甜乳清液總蛋白質含量存在類似差異。甜乳清液是酶凝型硬質干酪的副產物，在干酪生產中添加凝乳酶促進酪蛋白凝乳，凝乳期間凝乳酶切割κ-酪蛋白的Phe105-Met106鍵，產生p-κ-酪蛋白和糖巨肽（glyco macro peptide，GMP），p-κ-酪蛋白附著在酪蛋白膠束的表面進入干酪中，而GMP則保留在乳清液中，使甜乳清液總蛋白含量升高。HW的總蛋白質含量最低，為11.620%，與NYW、SYW均差異顯著（P＜0.05）。NYW和SYW灰分含量差異顯著（P＜0.05），NYW比SYW高出3.156%，Alsaed等[14]也發現，荷斯坦原乳清液和甜乳清液灰分含量差異顯著（P＜0.05）。有研究指出，pH值影響荷斯坦乳清液中的礦物質含量，主要是由于pH值對磷酸鈣鹽平衡產生不同程度的影響，溶液pH值為7.2時，乳清液中H2PO4-的含量最高，達到75%，當pH值降至5.0～6.2，導致H2PO4-含量增加，破壞了磷酸鈣鹽平衡，導致大量的磷酸鹽和鈣鹽溶解在乳清液中，當pH值小于5.0時，這種變化趨勢更明顯[15]。HW灰分含量最低，為4.766%，顯著低于NYW和SYW（P＜0.05），LI Haimei等[5]測定表明，牦牛原料乳礦物質總量高于荷斯坦原料乳。

2.2 牦牛乳清粉溶解性分析

圖1 牦牛乳清粉的溶解性Fig. 1 Solubility of yak whey powder

溶解性是物質的固有特性，乳清粉的溶解性影響其在乳化和起泡等方面的應用[16]。由圖1可知，NYW和SYW溶解性有顯著差異（P＜0.05），SYW的溶解性比NYW高出7.128%。溶解性受到乳清粉pH值對β-乳球蛋白（β-lactoglobulin，β-Lg）聚合形式的影響，Cheison等[17]研究指出，牛乳pH值對蛋白質結構起決定性作用，尤其是對β-Lg的結構影響較大，β-Lg占乳清蛋白的50%以上，其聚合物形式決定溶解性大小，當溶液pH值在5.1～7.0時，β-Lg主要以二聚體形式存在，此形式下β-Lg的溶解性高，而pH值在3.7～5.1時，β-Lg生成八聚體聚合物，溶解性較低。

2.3 牦牛乳清粉持水性及持油性分析

由圖2可知，N Y W的持水率顯著高于S Y W（P＜0.05），最高值達到45.2%，持油率顯著低于SYW（P＜0.05），SYW的持油率為4.073 mL/g。生產干酪的原料乳要經過巴氏殺菌的熱處理，甜乳清液中β-Lg和κ-酪蛋白相互作用產生影響；一些學者指出，熱處理使荷斯坦乳清粉中β-Lg部分變性，變性的乳清蛋白與酪蛋白膠束表面的κ-酪蛋白通過巰基-二硫鍵交聯形成聚合物，蛋白質分子疏水基團暴露出來并重新排列，疏水相互作用增強，蛋白質和水結合能力下降，從而改善SYW的持油能力，但同時降低SYW的持水能力[18-19]。本研究中市售HW的持水率和持油率最低，分別為15.5%和2.223 mL/g。

圖2 牦牛乳清粉的持水性及持油性Fig. 2 Water-holding capacity and oil-holding capacity of yak whey powder

2.4 牦牛乳清粉起泡性及泡沫穩定性分析

圖3 牦牛乳清粉的起泡能力及泡沫穩定性Fig. 3 Foaming ability and foam stability of yak whey powder

由圖3可知，NYW和SYW的起泡能力和泡沫穩定性均存在顯著性差異（P＞0.05），差值分別為2.33 mL和6.946%，HW由于起泡量太少不進行對比。造成起泡能力差異性的主要原因有2 個，其一是NYW和SYW的總蛋白質含量存在顯著差異（P＜0.05），Martinez-Padilla等[20]發現，不同蛋白質含量的荷斯坦乳清蛋白起泡能力不同，起泡能力隨著乳清蛋白含量的增加而提高，這是由于隨著蛋白質含量增加，空氣-水界面的蛋白質吸附能力增強，乳清蛋白中的β-Lg競爭性分布在空氣-水界面，起泡能力增強。Kamath等[21]也指出，蛋白質含量較高時，空氣-水界面吸附的蛋白質含量較高，形成較厚的黏彈性膜，泡沫不易發生破裂，泡沫穩定性增強。其二是乳清液來源不同造成SYW泡沫穩定性的差異性，Kamath等[21]研究發現，熱處理過程中，變性乳清蛋白和κ-酪蛋白形成膠束物質，改善荷斯坦乳清蛋白的泡沫穩定性，這是由于形成的膠束物質分散在泡沫空氣-水界面，界面黏性增強，形成的黏彈性膜穩定性較好，不易受外界條件影響。

2.5 牦牛乳清粉乳化活性及乳化穩定性分析

圖4 牦牛乳清粉的乳化活性及乳化穩定性Fig. 4 Emulsifying activity and emulsion stability of yak whey powder

乳化性是蛋白產品的重要功能特性之一，對產品最終形成穩定的乳液體系發揮重要作用[22]。由圖4可知：NYW和SYW的EAI和ESI均有顯著性差異（P＜0.05），SYW的EAI為2.399 m2/g，ESI達45.87%，與NYW的差值分別為0.338 m2/g和12.534%；HW的ESI比牦牛乳清粉低，為30.137%。Ye Aiqian[23]研究荷斯坦乳清蛋白乳化特性后指出，蛋白質含量決定乳液穩定性大小，含量越高，EAI和ESI越高。此外，熱處理會改善乳液穩定性，熱處理導致蛋白質聚集，聚集體可能會限制表面蛋白的有效擴散和重排，從而提高乳液穩定性。這同時闡述了SYW的乳化活性和乳化穩定性較好的原因。

2.6 牦牛乳清粉熱穩定性分析

圖5 牦牛乳清粉的熱穩定性Fig. 5 Thermal stability of yak whey powder

熱處理廣泛應用于牛乳加工過程，以延長乳制品的貨架期，乳清蛋白是一種熱不穩定性物質，在熱處理過程中極易發生變性[24]，本研究探究牦牛乳清蛋白在60～90 ℃的熱穩定性。由圖5可知：NYW和SYW在60 ℃條件下的沉淀率分別為0.055%和0.077%，說明牦牛乳清粉60 ℃時開始發生變性；NYW和SYW在75 ℃以后沉淀率均顯著增高，85 ℃時達到最大值，分別為0.151%和0.175%，隨后沉淀率均變化不顯著（P＞0.05），表明NYW和SYW在85 ℃最不穩定，易產生沉淀。不同的處理溫度會不同程度影響產品的功能性質，Corredig等[25]研究70～90 ℃熱處理溫度下荷斯坦乳清蛋白和酪蛋白間的熱誘導機制后指出，熱處理溫度在75～90 ℃時，隨著熱處理溫度的升高，發生變性的荷斯坦乳β-Lg含量增加，變性的β-Lg和κ-酪蛋白膠束相互作用增強，當溫度達到90 ℃時，α-乳白蛋白（α-lactalbumin，α-LA）開始變性，變性的α-LA和β-Lg不僅和κ-CN發生相互作用，它們之間也存在相互作用，這說明熱處理影響乳清蛋白結構，從而改變乳清蛋白的功能性質。Laleye等[26]研究表明，熱處理降低了荷斯坦乳清蛋白的熱穩定性。HW在80 ℃時沉淀率最大，說明來源于荷斯坦牛乳的HW在80 ℃最不穩定。

3 結 論

NYW和SYW的總蛋白質含量均顯著高于HW（P＜0.05），可以作為優質蛋白質資源應用和開發。NYW和SYW的熱變性溫度為85 ℃，明顯高于HW的熱變性溫度（80 ℃）。SYW是回收利用干酪加工排放的乳清廢液，該乳清液經歷了干酪加工前原料乳的巴氏殺菌熱處理，該處理有效提高了SYW的溶解性、持油性、起泡能力、泡沫穩定性、乳化活性和乳化穩定性。本研究表明，牦牛乳清粉營養價值高，功能特性突出，具有極好的應用前景，研究結果為牦牛乳清粉的應用和發展提供了重要理論依據。