不同產地羅漢果總皂苷、甜苷V和硒含量及指紋圖譜研究

楊鳳軒，李 剛，袁漢文*，夏祥華，夏 勉，周 瓊

1廣西民族大學 廣西高校微生物與植物資源利用重點實驗室，南寧 530006；2廣西藥用植物園，南寧 530023；3蒼溪縣國家現代農業示范區院士工作站，蒼溪 628400；4廣西大學農學院，南寧 530004

羅漢果(Siraitiagrosvenorii)是我國特有的傳統保健藥材，具有止咳、祛痰、潤肺、降血糖、保肝、抗癌等多種作用[1-3]，是首批被國家衛生部公布的藥食兩用中藥材[4]。研究表明，羅漢果中最主要的有效成分為葫蘆烷型四環三萜皂苷類，以羅漢果甜苷V為主，是一類強甜味的非糖物質，其甜度是蔗糖的256～344倍，且其皂苷的苷鍵均為β鍵，人體不能將其分解消化[5]，食用后不會引起機體的血糖升高，屬于“低卡路里食品”[6,7]。因此，羅漢果不僅有抗霧霾的開發潛力，還可作為藥品、食品相關的功能產品為包括糖尿病和肥胖癥患者等在內的廣大人群食用，需求量日益增長[8]。

但傳統中，羅漢果主要分布于廣西、湖南等熱帶、亞熱帶地區[9]。隨著羅漢果在各領域的應用不斷拓寬，國內外市場需求不斷加大，廣西、湖南、四川等省份地區的羅漢果種植面積越來越廣，考察控制不同產區果實品質，直接關系到羅漢果深加工產業的質量與發展[10]。

硒元素是人體必需微量元素之一，在人體內具有提高免疫力、防癌抗癌、抑制艾滋病、糖尿病等作用[11]。近年來針對我國廣泛存在的硒的“隱形饑餓”問題，各地硒產業競相發展，硒資源的開發利用迎來前所未有的熱潮，但未曾有不同產區羅漢果中硒含量相關的系統研究報道[12]。

本文擬采用香草醛-濃硫酸分光光度比色法、高效液相色譜法和氫化物原子熒光光譜法對10個不同產地羅漢果總苷、甜苷V和硒進行含量測定，為羅漢果的推廣種植、科研和開發利用等提供參考指導。

1 材料與方法

1.1 材料

羅漢果果實，取自四川、湖南、廣西等9個地區(參見表3)，每個樣品地區隨機摘取15個成熟“青皮果”樣品，統一經50 ℃烘烤至恒重，粉碎，混勻，過50目篩后置密封袋備用。

1.2 試劑與儀器

羅漢果甜苷V對照品，純度≥ 98%(北京索萊寶科技有限公司)；硒標準品：濃度1 000 μg /mL，介質為10%鹽酸(國家鋼鐵材料測試中心鋼鐵研究總院)。AB-8型大孔吸附樹脂(天津市光復精細化工研究所)；乙腈為色譜級(美國Fisher公司)，硝酸、高氯酸、鹽酸、氫氧化鉀、硼氫化鉀為優級純，其余所用試劑均為分析純，水為超純水。

安捷倫1260高效液相色譜儀；色譜柱Alltima(TM)C18(4.6 mm × 250 mm，5 μm)752 N型紫外可見分光光度計；AFS-8220原子熒光光度計：配硒空心陰極燈；CEN微波消解儀：配聚四氟乙烯消解罐；EHD-12電熱消解儀。

1.3 方法

羅漢果總甜苷、甜苷V及硒含量的測量具體方法如下述。首先對各指標的測量進行精密度、穩定性和重復性等方法學考察。然后，每個指標各樣品均設三次重復，RSD < 10%。分別采用外標法，建立標準曲線，計算各指標的含量。對實驗數據采用Excel進行處理，采用SAS軟件進行差異顯著性的方差分析和新復極差測驗。

1.3.1 甜苷V的含量測定

甜苷V含量的測定方法根據《中國藥典》(2015年版)[13]中羅漢果含量測定的高效液相色譜法。

甜苷V對照品的配制：精密稱取羅漢果甜苷V標準品5 mg，置于25 mL容量瓶中，用乙腈-水(22∶78)溶液經超聲溶解至刻度線，搖勻，得羅漢果甜苷V標準品溶液(0.233 6 mg/mL)，濾液經0.45 μm的微孔濾膜過濾，即得。

試樣的制備：每個樣品設置三個平行，加入甲醇加熱回流兩個小時，續濾液于旋轉蒸發儀蒸干后用水溶解，AB-8大孔吸附樹脂柱洗脫，收集洗脫液蒸干；殘渣轉移至10 mL量瓶中，加流動相定容，過濾，即得。

分別將甜苷V對照品與試樣注入高效液相色譜儀進行測定，記錄各峰面積，按外標法[13]計算含量。

1.3.2 總皂苷含量的測定

總皂苷含量的測定方法根據李鋒等[14]香草醛—濃硫酸試劑分光光度計比色法。

總皂苷標準品的配制：精準稱取羅漢果對照品5 mg配制成1.0 mg/mL的水溶液。分別精確吸取標準中間液100、150、200、250、300 μL，加水稀釋到0.5 mL，再加入10%香草醛乙醇溶液0.5 mL。冰浴下加入75%硫酸5 mL。在恒溫水浴鍋中50 ℃加熱20 min。在冰浴中冷卻10 min，同時做空白試劑。

試樣的配制：羅漢果粉于甲醇中浸泡12 h后加熱回流6 h，上清液水浴蒸干；用水分洗滌并轉移至AB-8型大孔樹脂柱洗脫，收集醇液并蒸干；殘渣以熱水溶解于5 mL容量瓶中定容，后同標準品，作為供試品溶液。

1.3.3 硒含量的測定

硒含量的測定根據《食品安全國家標準》[15]食品中硒的測定，氫化物原子熒光光譜法測定。

硒標準品的配制：精確吸取1 mL硒標準溶液加入5%鹽酸溶液配制成濃度10 μg/mL中間液。分別利用100 g/mL鐵氰化鉀與5%鹽酸溶配制出硒標準系列溶液，質量濃度分別為0、1、2、4、6、8、10 μg/L。

硒試樣的制備：微波消解法，羅漢果粉分別加入硝酸與過氧化氫，于微波消解儀硝化，后轉入電熱消解儀加熱至近干，加6 mol/L鹽酸溶液繼續加熱至澄清，加入2.5 mL鐵氰化鉀溶液(100 g/mL)，用水定容至10 mL容量瓶中，同時做質控和空白試樣。

檢測與條件：以5%鹽酸溶液為載流，硼氫化鉀堿溶液為還原劑(現配現用)，儀器條件為，光電倍增管負高壓270 V，燈電流80 mA，載氣流量300 mL/min，屏蔽氣流量800 mL/min，原子化器高度8 mm，注入量0.5 mL。

2 結果與討論

按1.3.1色譜條件，得到指紋圖譜如圖1，樣品色譜圖與對照品色譜圖相應的位置上有相同保留時間的色譜峰，由此可確定甜苷V的出峰時間。

羅漢果甜苷V檢測方法學考察結果表明，取同一供試品溶液，重復進樣6次，RSD為1.39%(n= 6)，精密度良好；取供試品溶液置于室溫下，分別于0、4、8、12、24 h進樣10 μL，測定甜苷V吸收峰面積，計算RSD值為2.19%，表明供試品溶液在室溫下放置24 h穩定；按供試品溶液制備方法將5號樣品制備6個重復，依法測定，6個樣品峰面積RSD為1.91%。

檢測發現，以相同方式處理不同產地羅漢果，其色譜圖有一定的相似度，但色譜峰的強度有明顯差異，以各地區甜苷V的出峰面積為參量，利用SPSS軟件做指紋圖譜的聚類分析，結果如圖二。不同產地羅漢果甜苷V含量可分為四類，第一類為2、5、6、7號樣品，8、9號樣品為第二類，1、4號樣品為第三類，3號樣品為第四類。說明不同產地相同品種羅漢果甜苷V含量具有一定差異，但與省份之間的關聯不明顯。

圖1 羅漢果標準品與不同產地羅漢果樣品指紋圖譜Fig.1 Fingerprint of Siraitia grosvenorii standard and samples from different habitats注：a：羅漢果甜苷V標準品色譜圖；b：9個產地羅漢果樣品指紋圖譜。Note:a:Chromatography of Siraitia grosvenorii Glycoside V standard;b:Fingerprint of Siraitia grosvenorii samples from 9 habitats.

分別將總皂苷標準系列在600 nm檢測波長的紫外分光光度計中進行檢測，以吸光值(abs)為橫軸，以羅漢果皂苷量(μL)為縱軸，制作標準曲線為其中y= 59.683x-5.003 2，R= 0.999 39。

羅漢果總皂苷檢測方法學考察結果表明，取同一供試品溶液，重復檢測6次，RSD為1.26%(n= 6)，精密度良好；取供試品溶液置于室溫下，分別于0、15、30、40、50、60 min進樣10 μL，測定吸光度，計算RSD值為1.87%，表明，供試品溶液在室溫下放置24 h穩定；按供試品溶液制備方法將5號樣品制備6個重復，依法測定，6個樣品吸光值RSD為2.61%，具有較好的重復性。

圖2 不同產地羅漢果樣品指紋圖譜聚類分析圖Fig.2 Cluster analysis for fingerprints of Siraitia grosvenorii samples from different habitats

按1.3.2方法測定總皂苷吸光度，將吸光值代入標準曲線計算各樣品總皂苷含量。并進行羅漢果樣品中甜苷V、總苷含量的差異顯著性分析、多重比較，以及總苷中甜苷V占比計算，結果匯總如表1。

分別將硒標準系列導入原子熒光光度計測其熒光強度，以熒光強度為橫坐標，質量濃度為縱坐標，得出標準曲線y= 0.020 12x+ 0.123 65，其中R= 0.999 99。

在相同條件下，將樣品溶液分別按順序導入儀器，質控樣品在其范圍之內，得出樣品濃度并計算[15]硒含量，結果整理并經統計分析后匯總如表2。

表1 不同產地羅漢果甜苷 V 、總苷含量測定結果

注：差異顯著水平P<0.05；不同字母表示多重比較的顯著差異。

Note:Significant difference levelP<0.05;Different letters indicate the significance of the difference.

表2 不同產地羅漢果硒含量測定結果

注：差異顯著水平P<0.05；不同字母表示多重比較的顯著差異。

Note:Significant difference levelP<0.05;Different letters indicate the significance of the difference.

由表1可知，就甜苷V含量而言，湖南湘西回龍路果實中最高，其次是廣西南寧西鄉塘區，分別是1.42%和1.41%，湖南湘西龍山縣茅坪鄉的最低，為0.68%；就總皂苷含量而言，湖南懷化市辰溪縣火馬沖產羅漢果果實中含量最高，為3.34%，湖南湘西龍山縣咱果鄉土車村的最低，含量為2.42%；就總皂苷中甜苷V的占比而言，樣品來源前面三位由高到低依次為：湖南湘西龍山縣民安鎮回龍路、廣西桂林永?？h龍江鄉保安村、廣西桂林市臨桂區兩江鎮，分別為：56.48%、52.06%和49.34%，占比最低的是湖南湘西龍山縣茅坪鄉的果實，為28.03%。

近年來，隨著羅漢果的種植、開發等相關產業的迅速發展，對羅漢果成分的測定和質量控制也日益受到重視。劉金磊等[10]分別采用紫外分光光度比色法和高效液相色譜法測定了桂北不同產地、不同品種羅漢果中的總皂苷和甜苷V的含量，總皂苷和甜苷V含量范圍分別為2.45%～3.36%和0.81%～1.94%。周小雷等[16]建立HPLC測定羅漢果藥材中羅漢果甜苷 V含量的方法，對不同品系羅漢果甜苷V的含量進行了測定，測得羅漢果甜苷V含量范圍為0.25%～1.44%。本實驗采用香草醛-濃硫酸分光光度比色法和高效液相色譜法對不同產地羅漢果總苷和甜苷V含量進行測定，甜苷V和總皂苷含量范圍分別為0.68%～1.42%和2.42%～3.34%，接近前人的研究結果。廣西、湖南、四川3個省份由南到北，緯度由低到高，但不論是總皂苷和甜苷V的含量，還是甜苷V在總皂苷中的占比，3個省份羅漢果果實樣品之間沒有表現出隨緯度的差異顯著性的規律性變化。

基因組和轉錄組研究[17-19]表明，大量基因參與羅漢果果實發育及品質形成，不同時期果實中分別有不同的中間代謝產物。由前述結果可知，盡管羅漢果果實發育時期一致，但總皂苷及甜苷V的含量不同，由于實驗材料均為遺傳背景相對一致的青皮果，造成這些差異的原因可能在于，不同產區溫度、光照、肥、水等生長條件的差異導致果實生長期溫光積累和營養條件不同，由于羅漢果皂苷合成進度不一致，因此，對于不同產區的羅漢果，宜根據品質要求進行抽樣分析，以確定適齡的果實收獲期。

由表2可見，湖南懷化市辰溪縣火馬沖的羅漢果果實中硒含量最高，其次是廣西南寧市西鄉塘區的和廣西桂林市臨桂區兩江鎮的，其硒的含量分別為41.462、32.696、32.373 μg/kg。鄧衛利等[20]測定桂林山區種植的普通羅漢果硒含量為57 μg/kg，與本實驗結果相近，而其培育的富硒羅漢果硒含量為109 μg/kg，遠遠高于普通羅漢果硒含量。沈麗水等[21]研究發現，不同地區種植中草藥含硒量差異明顯，如高硒區陜西省紫陽縣產防風、益母草、淫毛藿、升麻、白芨五種中草藥平均含硒3.38 mg/kg，而天水產這5種中草藥平均含硒0.52 mg/kg，表明高硒土壤中生長的中草藥含硒相對較多。本實驗中不同地區羅漢果中硒含量并沒有表現出省份間差異變化的規律性，但是各地區硒含量差異顯著，表明不同土壤類型等可導致果實中的硒含量不同，因此，可通過改善種植區土壤硒含量等培育富硒羅漢果。

3 結論

由結果分析與討論可知，在廣西、湖南和四川等地，果齡相同時收獲羅漢果果實，其主要品質指標總皂苷和甜苷V接近傳統產區的一般調查結果，即總皂苷含量在2.42%～3.34%之間，甜苷V含量在0.68%～1.42%之間，羅漢果甜苷V可達到藥典的0.5%的合格要求；不同產地間的羅漢果其總皂苷含量差異不顯著而甜苷V差異顯著，但這兩個指標并沒有表現出隨緯度高低變化而在不同產地之間具有顯著差異的規律性特征，其原因可能在于，具體產地羅漢果果實發育期甜苷合成代謝存在差異，與具體產地果期有效積溫、水、肥、氣等栽培環境條件不同有關，因此，應該根據年度氣候條件和農藝管理等具體情況，通過抽樣檢測，建立合適的采收期，其具體影響還有待系統深入的研究。此外，本實驗采用氫化物原子熒光光譜法首次對不同產地羅漢果硒含量進行測定，發現不同產地土壤條件下羅漢果中硒的含量具有顯著差異，為富硒優質羅漢果的種植提供了參考。