小反芻獸疫病毒間接化學發光抗體檢測方法的建立與優化

任雪建 李秀梅 楊曉帆 李亞靜 楊志 耿玉靜 呂園園

摘要：構建了原核表達質粒pET-28a-N，經原核表達純化獲得小反芻獸疫病毒N蛋白。將純化的小反芻獸疫病毒N蛋白與對應的酶標二抗配對，通過對各個反應條件的優化建立了間接化學發光抗體檢測方法。通過對血清樣本的檢測，對該方法的敏感性、特異性、重復性、符合率進行了評價。試驗結果顯示：N蛋白最適包被濃度為0.5 μg/mL，最適包被條件為4℃ 24 h;酶標二抗最適工作濃度為1∶2000。特異性試驗證明，該方法與羊常見病毒的抗體陽性血清沒有交叉反應。通過檢測大量小反芻獸疫病毒抗體陰、陽型血清，確定了科學的判定標準。

關鍵詞：原核表達;最適條件;臨界值

中圖分類號：S854.4+3文獻標識碼：A文章編號：2095-9737（2019）10-0001-05

小反芻獸疫（Peste des Petits Ruminants，PPR）是由小反芻獸疫病毒（Peste des Petits Ruminants Virus，PPRV）引起的一種反芻動物的烈性病毒性疾病。小反芻獸疫病毒具有高度傳染性，綿羊和山羊為主要感染動物，偶爾感染野生小反芻動物，例如巖羊、野山羊等[1]。世界動物衛生組織（OIE）將其列為必須報告的動物疫病，我國將其列為一類動物疫病。在《2018年國家動物疫病強制免疫計劃》規定對全國所有羊進行小反芻獸疫免疫。本試驗利用原核表達的小反芻獸疫N蛋白作為包被抗原與其酶標二抗配對，構建了間接化學發光抗體檢測方法。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?主要試劑

pET-28a原核表達載體、BL21感受態細胞由本公司實驗室保存;法國ID-VET《小反芻獸疫抗體檢測試劑盒》購于上海拜力生物科技有限公司;小反芻獸疫活疫苗（Clone9株）購于新疆天康畜牧生物技術股份有限公司。

1.1.2?血清樣本

小反芻獸疫陽性血清、小反芻獸疫陰性血清購于中國獸醫微生物菌種保藏管理中心。500份已知來源的臨床羊血清由洛陽萊普生信息科技有限公司提供，并經法國ID-VET小反芻獸疫病毒阻斷ELISA抗體檢測試劑盒檢驗證明。

1.2?方法

1.2.1?小反芻獸疫N蛋白的表達

小反芻獸疫病毒是單股負鏈RNA病毒，編碼8種已知蛋白，其中6種為結構蛋白，分別為核衣殼蛋白（N）、磷蛋白（P）、基質蛋白（M）、大蛋白（L）、血凝素蛋白（H）和融合蛋白（F）。大多數血清學檢測技術是針對小反芻獸疫病毒的核衣殼蛋白和血凝素蛋白而建立的[2]。大多數的單鏈RNA病毒，包括小反芻獸疫病毒在內，N蛋白高度保守，免疫原性也較高。由于接近病毒基因組的3'末端，N蛋白的含量比其他結構蛋白都要高。雖然針對N蛋白的抗體不能保護動物免受該病侵害，但由于抗原性較好而且含量豐富，N蛋白仍然是小反芻獸疫診斷工具最易接受的目標[3]。

從gene bank上查找小反芻獸疫N蛋白的基因序列號為AJ563705.1，并設計引物。上游引物序列為：5'-AATAGGATCCGCG CACGTGAACGACATGCTGA -3'，下游引物序列為：5'-CGGAAGCTTAATGTCGTAGAACTTGAGCGTGTG-3'。使用RNA提取試劑盒從小反芻獸疫疫苗中提取病毒核酸。并通過反轉錄PCR獲得cDNA，使用上述一對引物擴增出小反芻獸疫N蛋白主要抗原表位區基因。將擴增出來的目的基因、pET-28a空載體分別經雙酶切之后與pET-28a載體連接。將重組質粒轉化BL21大腸桿菌感受態細胞。經過條件篩選，確定合適的IPTG誘導濃度，培養溫度。經表達純化獲得的小反芻獸疫N蛋白可作為試劑盒生產中的包被抗原使用。

1.2.2?包被緩沖液的選擇

分別選取25mM PBS（pH值7.4）、碳酸鹽緩沖液（pH值9.6）、50mM Tris-HCl（pH值8.0）作為包被緩沖液，包被濃度均為1 μg/mL。每孔100 μL，2～8℃放置24 h。用PBST洗板2次，每孔加入1.5% BSA，2～8℃封閉24 h。陽性對照血清1/20稀釋之后加入到化學發光反應板中，每孔加入100 μL，最后一行作為無血清對照。37℃反應1 h，PBST洗滌5次，吸水紙上拍干之后，每孔加入100 μL工作濃度的羊抗豬酶標二抗。37℃反應1 h，PBST洗滌5次，吸水紙上拍干之后，每孔加入化學發光底物A液50 μL、化學發光底物B液50 μL。室溫、避光反應5 min，使用化學發光免疫分析儀讀數。

1.2.3?包被條件的摸索

分別選取37℃ 3 h、4℃ 16 h、4℃ 24 h、三種包被條件進行摸索。以1 μg/mL的蛋白濃度進行包被，每孔加入100 μL。使用1.5% BSA封閉，陽性對照血清1/20稀釋之后加入化學發光反應板進行反應。選擇化學發光值高，并且變異系數最小的條件進行包被。

1.2.4?封閉緩沖液的選擇

分別選取 1.5% BSA、1%酪蛋白、10%馬血清、3%明膠作為封閉液。封閉條件為2～8℃24 h。在化學發光反應板上測定陽性對照血清、陰性對照血清，計算二者化學發光值的比值（P/N），根據比值大小確定最適封閉液。

1.2.5?血清稀釋倍數和抗原包被濃度的確定

使用棋盤滴定法來篩選最佳條件。使用包被緩沖液在化學發光包被板上按照濃度梯度進行包被。選取陽性對照血清、陰性對照血清進行梯度稀釋，進行測定。實驗布局如表1所示。根據最終讀取的化學發光值計算陽性對照血清、陰性對照血清二者的比值（P/N），比值最大時為最適抗原包被濃度與血清稀釋倍數。

1.2.6?酶標二抗最適濃度的篩選

使用不同濃度的酶標二抗，對同一份強陽性血清進行測定。由于高濃度的酶標二抗處于過量狀態，多余的二抗并不會結合到抗原-抗體復合物上。在酶標二抗過量的濃度區間內化學發光值下降緩慢，隨著酶標二抗濃度的逐漸下降，化學發光值會呈現明顯下降趨勢?；瘜W發光值明顯下降的拐點處所對應的酶標二抗濃度即是最適工作濃度。

1.2.7?臨界值的確定

收集臨床血清樣本400份使用青島立見小反芻獸疫病毒阻斷ELISA抗體檢測試劑盒進行測定，其中陽性219份，陰性181份。使用建立好的實驗體系，測定400份臨床血清樣本，實驗結果按照S/P=樣本OD值/陽性對照OD進行計算。使用SPSS軟件對所有血清的S/P值與已知結果進行統計分析，并繪制ROC曲線，取Youden指數最大時對應的S/P值作為臨界值。

1.2.8?交叉實驗

使用建立的實驗體系，測定羊口蹄疫O型病毒陽性血清、山羊痘病毒陽性血清、綿羊痘病毒陽性血清，同時設小反芻獸疫病毒陽性血清作為對照。根據實驗結果觀察化學發光方法的交叉反應性。

2?結果與分析

2.1?重組蛋白表達及驗證

2.1.1?pET-28a-N重組質粒的構建及驗證

將擴增的PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，如圖1所示，在紫外燈下進行觀察，目的條帶位置與已知的1578bp符合。

使用膠回收試劑盒將目的片段回收。將目的片段與pET-28a空載體進行雙酶切，酶切之后將產物回收進行連接。連接產物轉化BL21感受態細胞，固體培養基篩選得到單菌落，挑取單菌落使用液體培養基繼續培養，提取之后進行雙酶切，酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳驗證，在1578bp附近有目的條帶出現。同時將構建好的質粒進行測序，比對結果顯示沒有堿基錯配。

2.1.2?pET-28a-N重組蛋白的表達及純化

將重組質粒pET-28a-N轉化BL21感受態細胞，進行培養誘導表達，分別取誘導前菌液，誘導后菌液超聲波破碎的菌體沉淀和上清進行SDS-PAGE電泳分析，結果如圖2所示。誘導后產物中有重組蛋白表達，分子量約為60kDa。大量誘導表達產物經Ni-NTA樹脂親和層析純化后進行SDS-PAGE電泳分析，得到分子量在80kDa左右的高純度蛋白，如圖2所示。

2.1.3?重組蛋白反應性驗證

純化之后目的蛋白進行SDS-PAGE電泳，轉膜結束之后使用小反芻獸疫標準陽性血清進行孵育，然后加入鼠抗羊酶標二抗進行顯色。結果顯示：目的蛋白能夠與陽性血清結合，在80kDa位置出現條帶，而空白對照泳道在該位置無條帶產生。結果如圖3所示。

M：蛋白Maker;1：空載體誘導表達產物;2：誘導表達產物;3：誘導表達產物上清;4：純化之后目的蛋白

M：蛋白Maker;1：目的蛋白與陽性血清反應結果;2：空白對照

2.2?包被緩沖液的選擇

分別使用三種包被緩沖液進行包被，實驗結果如表2所示。其中CB包被時抗原吸附效率最高，并且P/N值最大，所以確定使用CB作為抗原包被緩沖液。

2.3?包被條件的確定

分別按照37℃ 3 h、4℃ 16 h、4℃ 24 h、三種包被條件進行。選取一份弱陽性樣本S1進行實驗，根據發光值計算變異系數，變異系數最小的條件為最適條件。對實驗結果進行統計。發光值結果如表3所示，3種包被條件下發光值高度無明顯差異，但是4℃ 24 h條件下發光值變異系數最小，更有利于實驗結果的準確性。

2.4?封閉緩沖液的選擇

使用三種封閉緩沖液在2～8℃條件下封閉24 h。使用陽性對照血清、陰性對照血清進行測定，比較P/N值。結果顯示，10%馬血清作為封閉液時，陰性血清的本底值最低，且陽性樣本與陰性樣本的區分程度最大。

2.5?抗原包被濃度及血清稀釋倍數的選擇

使用棋盤滴定法確定最佳的抗原包被濃度和血清稀釋度，實驗布局如表1所示。將已經確定為陰性和陽性的血清梯度稀釋，分別加100 μL稀釋后的血清樣本到包被板，震蕩混勻，37°C孵育30 min;洗板5次，拍干。加入100 μL 酶結合物，震蕩混勻，37°C孵育30 min;洗板5次，拍干。加入50 μL發光底物液A和50 μL發光底物液B，震蕩混勻，室溫避光5 min，使用化學發光儀讀值，記錄結果。結果顯示，其中血清1∶40稀釋時陽性血清信號值高度處于100000～150000之間，陰性血清發光值大于10000能夠保證整個實驗體系的樣本值均處于化學發光儀精密性范圍之內，在血清1∶40的條件里，抗原0.5 μg/mL包被時抗原用量最少，陰陽區分明顯。所以，選擇抗原0.5 μg/mL包被，血清1∶40稀釋作為最適條件。結果見表5。

2.6?酶標二抗最適工作濃度篩選

用優化后的抗原包被濃度和血清稀釋度，將酶標二抗做梯度稀釋。加100 μL血清樣本到包被板，震蕩混勻，37°C孵育30 min;洗板5次，拍干。加入100 μL 酶結合物，震蕩混勻，37°C孵育30 min;洗板5次，拍干。加入50 μL發光底物液液A和50 μL發光底物液B，震蕩混勻，室溫避光5 min，使用化學發光儀讀值，記錄結果，結果見表6。其中酶標二抗濃度為1∶2000時，陽性血清發光值在150000左右，陰性血清發光值大于10000，整個實驗體系信號值高度處于化學發光儀精密性良好區間，且酶標二抗1∶2000時，陰陽樣本區分較大。

2.7?臨界值確定

用法國ID-VET抗體檢測試劑盒標定血清500份，陽性樣本289份，陰性樣本211份。使用建立的化學發光抗體檢測方法進行測定。用ROC曲線來確定臨界值，敏感性代表陽性檢出率，特異性代表因陰性檢出率;當相關標準>0.39時，Youden指數最大為0.9479，所以確定S/P=0.4為臨界值，當S/P≥0.4時，判定為陽性;S/P<0.4時，判定為陰性。ROC曲線如圖3所示，陽性符合率為100%，陰性符合率為94.8%。

2.8?交叉反應

使用已確定條件進行實驗，測定羊口蹄疫O型病毒陽性血清、山羊痘病毒陽性血清、綿羊痘病毒陽性血清，同時設小反芻獸疫病毒陽性血清作為對照。檢測結果如表7所示，說明本方法與上述羊常見病抗體無交叉反應。

3?討論

小反芻獸疫作為一種危害十分嚴重的接觸性傳染病，對經濟影響非常大，許多國家通過弱毒疫苗免疫來控制該病。自然感染后康復的動物和免疫后的動物均可以產生終生免疫，即動物感染小反芻獸疫病毒以后能終身產生抗體，持續產生抗體反應，對再次感染可以產生完全保護，因此，抗體是一個很好的指標。大規模監測小反芻獸疫主要由血清學方法完成[4]。

小反芻獸疫病毒間接法化學發光抗體檢測試劑盒使用的包被抗原為原核表達的N蛋白，具有高濃度、高活性、高純度等優勢，能夠滿足大批量生產。通過實驗證明表達的N蛋白具有敏感性高、特異性好等特點。同時，針對底物系統進行了優化，用發光底物代替了傳統的TMB底物，進一步提高了檢測的敏感性、特異性、穩定性，并且加入發光底物室溫反應5 min之后就可直接讀值。實驗操作更加簡便，明顯縮短了檢測時間。本試劑盒在開發過程中使用的血清樣本均經過進法國ID-VET試劑盒標定，最終的成品試劑盒陰、陽性符合率均大于95%。

參考文獻：

[1] Lefevre P C，Diallo A.Peste des prtits ruminants[J].Rev Sci Tech，1990，9（4）：935-981.

[2]Munir M，Zohari S，Berg M.Molecular biology and pathogenesis of peste des petits ruminants virus[M].Springer Berlin Heidelberg，2013.

[3]Diallo A，Barrett T，Barbron M，et al.Cloning of the nucleocapsid protein gene of peste-des-petits-ruminants virus：relationship to other morbilliviruses[J].J Gen Virol，1994，75（Pt 1）：233-237.

[4]張喜悅，王志亮，劉春菊，等.小反芻獸疫病毒（PPRV）N蛋白的表達與ELISA檢測方法的建立[J].中國獸醫學報，2008（02）：146-148，156.