纖維素酶水酶法提取茶籽油的條件優化及茶籽油成品分析

余婷婷, 薛亞軍

(四川輕化工大學化學工程學院， 四川 自貢 643000)

引 言

油茶是中國南方特有的重要食用油樹，茶籽油是從油茶種子中提取的一種優質食用油[1]。茶籽油富含不飽和脂肪酸、維生素和礦物質，具有獨特的風味，容易吸收，并且可長時間儲存[2]。茶籽油與橄欖油的組分相似，物理化學性質相近，而橄欖油較茶籽油昂貴，因此茶籽油作為橄欖油替代品在食品、醫藥、化妝品等領域應用前景廣闊[3]。

傳統的茶籽油提取方法是壓榨法和浸出法[3]。壓榨法由于原料需高溫炒制且細胞破碎程度有限，使蛋白變性且出油率低，餅渣殘油率高，油料資源綜合利用率低，還易致毛油中苯并芘超標[4]。浸出法出油率可達95%[4]。但浸出法在油脂與溶劑的分離和濕粕脫溶過程能耗大，且有機溶劑易燃易爆，危害人體健康，存在安全和環境污染隱患[4]。目前全國油茶種植面積已達6550萬畝，茶油年產量50萬噸到60萬噸。今后平均每年將有200萬畝新造林進入豐產期，預計到2025年總產量將達到250萬噸，行業產值也將從當前千億級向萬億規模邁進[5]。開發一種處理量大、提取率高、安全環保的茶籽油提取方法迫在眉睫。水酶法是機械粉碎植物原料后，加入酶液，利用酶降解植物細胞壁，使細胞內容物比如油脂釋放，然后使用離心等方法收集。與傳統提油方法相比，水酶法出油率與浸出法相當[6]，但其對設備要求不高，作用條件溫和，原材料不經高壓高熱處理，不涉及有機溶劑，有利于副產品的綜合利用，同時提取物質品質較好[7]。目前水酶法已用于提取番茄籽油[8]、鱷梨油[9]、辣目子油[10]、山桐子油[11]、金瓜籽油[12]、核桃油[13]、茶籽油[14-16]等油脂提取。其中水酶法提取茶籽油近年來得到較多關注，比如：郭艷紅[17]研究了多種單酶提取茶籽油的最優條件；紀鵬[3]研究了微波輔助對水酶法提取茶籽油的影響；方學智[7]研究了復合酶提取茶籽油的最優條件和破乳方法。由文獻可知，淀粉酶水酶法和堿性蛋白酶水酶法提取茶籽油的反應時間分別為3小時[3]和4小時[4]。纖維素酶水酶法與堿性蛋白酶或淀粉酶水酶法相比，由于纖維素酶直接分解油茶籽細胞壁上的纖維素造成細胞壁破損，所需的反應時間可能會更短，使生產效率更高。因此我們選擇纖維素酶水酶法提取茶籽油。

目前對茶籽油的研究已經從簡單的提取優化發展到研究茶籽油的成分[18-19]、揮發性物質[20-21]、功效[22]等方面，如：王興進等[18]采用GC-FID分析茶籽油脂肪酸組分鑒別茶籽油質量；韓小苗等[20]對5種不同工藝提取的茶籽油的揮發性成分進行了研究；李梓銘等[21]研究了精煉過程對茶籽油脂肪酸與揮發性物質的影響；潘超等[22]研究了茶籽油脂對改善機體疲勞的影響。同時茶籽油的酸敗是加工過程中遇到的主要問題之一，油品的過氧化值和酸值是考察油品的新鮮度與安全性的重要指標之一[23-27]。如何浙華等[23]檢測了浸出油、土榨油和冷榨油等3種不同工藝制取油的酸價、過氧化值等質量安全指標，探明不同加工工藝對茶籽油品質與食用安全性的影響。目前水酶法提取茶籽油的研究對水酶法提取制得的茶籽油的成分以及品質研究還較少。本研究除對纖維素酶水酶法提取茶籽油進行條件優化外，還對提取的茶籽油的酸值、過氧化值以及成分進行了檢測分析，為今后研究纖維素酶水酶法提取茶籽油的應用提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料、試劑與儀器

油茶籽購自隨州市云霧山茶場。纖維素酶(30 000 U/g，最適溫度為30 ℃～50 ℃，最適pH值4～5)購自梯希愛(上海)化成工業有限公司。硫酸鈉、乙醇、碘化鉀、石油醚、乙醚、氯仿、冰醋酸等均為分析純，0.1 mol/L硫代硫酸鈉標準滴定液等試劑均來自成都市科龍化工試劑廠。

超純水制造系統(UPH-11-21T，成都超純科技有限公司)；集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(DF-101S，河南予華儀器有限公司)；離心機(TCL-16，四川蜀科儀器有限公司)；氣質聯用儀(TSQ 8000，Thermo Scientific)；分析天平(ESJ182-4，沈陽龍騰電子有限公司)；烘箱(T1-L101B，廣東美的廚房電器制造有限公司)等。

1.2 實驗方法

1.2.1 水酶法制備茶籽油

油茶籽脫殼，70 ℃烘干4 h。待茶籽冷卻后用粉碎機粉碎。茶籽粉過30目篩后放置于4 ℃冰箱備用。稱取21 g茶籽粉置于250 mL燒杯中，加入一定體積一定pH值的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液，放入水浴鍋中滅酶21 min(80 ℃)。待溶液冷卻至室溫后，向燒杯中加入一定量的纖維素酶。然后在一定溫度下水浴加熱，酶解一定時間，在酶解結束后進行第二次滅酶21 min(80 ℃)。收集混合液體，離心(8000 rpm，10 min)，取上層清油，稱重，按公式(1)計算茶籽油提取率。將提取得到的茶籽油，保存于4 ℃的冰箱中。每組實驗重復兩次。

(1)

其中，茶籽粉質量為21 g。

1.2.2 茶籽油水分及揮發物測定

采用空氣烘箱法(GB/T 5528-2108)[28]，檢測纖維素酶制得的茶籽油中水分及揮發物含量。實驗重復三次。

1.2.3 茶籽油過氧化值測定

采用硫代硫酸鈉滴定法[29]，檢測纖維素酶提取的茶籽油的過氧化值。實驗重復三次。

1.2.4 茶籽油酸值測定

采用酸堿滴定法[30]，檢測纖維素酶提取茶籽油的酸值。實驗重復三次。

1.2.5 茶籽油成分分析

采用GM-GC分析纖維素酶提取茶籽油中脂肪酸的組分[31-32]。進樣口溫度250 ℃；檢測器FID溫度270 ℃；柱溫180 ℃(5 min)—5 ℃/min—240 ℃(5 min)；分流比21∶1；H245 mL/min；空氣400 mL/min；N21.5 mL/min；尾吹氣體30 mL/min。實驗重復兩次。

2 結果與分析

2.1 提取條件優化

2.1.1 酶解時間對提取率的影響

給定條件：21 g茶籽粉，料液比1∶4(80 mL pH 4.5檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液)，0.038 g(60 U/茶籽粉g)纖維素酶，酶解溫度45 ℃。分別酶解0 min、45 min、60 min、75 min、90 min、105 min，提取率的情況如圖1所示。

圖1 纖維素酶酶解時間對提取率的影響

由圖1可知：當酶解時間由0 min增長到75 min時,茶籽油提取率明顯升高；酶解時間為75 min時，茶籽油提取率最高；繼續反應75 min后，提取率則緩慢地下降。這表明隨著酶解時間的增加，利于底物與纖維素酶充分結合，更多的植物細胞壁上的纖維被破壞，因此釋放出更多茶籽油。但酶解時間繼續增長，茶籽油中脂肪酸分子與水分子碰撞增多，其與水分子結合形成乳液，導致分相困難，使茶籽油的收率下降[33]。而且隨著反應時間增加，細胞漿液中的非酯物質也更易溶出，不利于茶籽油的分離收集[34]。因此考慮到時間成本以及產物收率情況，選擇75 min為最佳的酶解時間。

2.1.2 酶量對油茶籽油提取率的影響

給定條件：21 g茶籽粉，料液比1∶4(80 mL pH 4.5檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液)，酶解溫度45 ℃，酶解時間75 min。分別加入纖維素酶0.013 g(21 U/茶籽粉g)，0.025 g(40 U/茶籽粉g)、0.038 g(60 U/茶籽粉g)、0.051 g(80 U/茶籽粉g)、0.063 g(100 U/茶籽粉g)，考察酶量對油茶籽油提取率的影響，如圖2所示。

圖2 酶量對提取率的影響

由圖2可知，纖維素酶量對油茶籽油的提取率影響較大。當纖維素酶的添加量由21 U/茶籽粉g上升到60 U/茶籽粉g時，茶籽油提取率增大。這是因為當纖維素酶量小于60 U/茶籽粉g時，隨著酶量增大，更多的底物與纖維素酶結合，相同的反應時間，細胞壁破壞程度更大，有利于茶籽油從植物細胞中釋放出來。纖維素酶的添加量為60 U/茶籽粉g時，茶籽油提取率最高。繼續增加纖維素酶量，茶籽油的提取率增長趨勢變緩。當纖維素酶量大于60 U/茶籽粉g時，茶籽的量成為酶解反應的“短板”，沒有更多的底物與增加的纖維素酶結合，因此產物的量不再增加[33]。綜上，60 U/茶籽粉g為最佳的酶量。

2.1.3 料液比對茶籽油提取率的影響

給定條件：21 g茶籽粉，酶解溫度45 ℃，酶解時間75 min。分別加入60 mL(料液比1∶3)、80 mL(料液比1∶4)、90 mL(料液比1∶4.5)、100 mL(料液比1∶5)、121 mL(料液比1∶6)、140 mL(料液比1∶7)pH 4.5檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液，加入纖維素酶0.038 g(60 U/茶籽粉g)，考察料液比對茶籽油提取率的影響，如圖3所示。

圖3 料液比對茶籽油提取率的影響

由圖3可知，料液比由1∶3上升到1∶4時，茶籽油的提取率增大。料液比為1∶4時，茶籽油提取率達到最高。繼續增加料液比(料液比在1∶4～1∶5)，茶籽油的提取率保持不變。當料液比大于1∶5時，茶籽油的提取率大幅度減小。由于料液比是茶籽油提取中十分重要的影響因素[35]。料液比過小時，水分不能充分滲入到茶籽中，茶籽油不能完全溶出，同時部分茶籽受熱過多，形成焦糊狀，影響茶籽油風味，降低茶籽油得率[35]。而料液比過大時，液體體積增大造成纖維素酶和茶籽的濃度降低，纖維素酶與底物的結合需要消耗更多的時間和能量，使茶籽油提取率降低，同時還會增加能耗[33]。同時料液比增大，代表溶劑增大，這有利于油茶皂素的析出，而油茶皂素可與脂肪形成w/o乳化體系，這也會引起茶籽油提取率下降[34]。綜上，選取料液比為1∶4為最佳。

2.1.4 反應溫度對茶籽油提取率的影響

給定條件：21 g茶籽粉，加入80 mL(料液比1∶4)pH 4.5檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液，纖維素酶0.038 g(60 U/茶籽粉g)，酶解時間75 min。由于實驗所用纖維素酶的最適溫度為30℃～50℃，因此考察酶解溫度分別在41 ℃、42 ℃、45 ℃、47 ℃、49 ℃時對茶籽油提取率的影響，如圖4所示。

圖4 反應溫度對茶籽油提取率的影響

由圖4可知，當溫度由36 ℃上升到40 ℃時，茶籽油提取率隨溫度升高而上升，當體系溫度為40 ℃時，茶籽油提取率最高。這是因為在沒有超過酶最適溫度時，隨著溫度的升高，酶解反應速率逐漸加快[36]，相同反應時間細胞壁裂解程度加大，有利于茶籽油從細胞中釋放。同時體系溫度升高可以增大分子擴散系數，降低溶劑及油脂黏度，加快油脂分子的擴散速度[34]。因此茶籽油提取率升高。而繼續提高酶解溫度(40 ℃～44 ℃)，茶籽油的提取率下降。這可能是由于該溫度超過了纖維素酶的最適反應溫度，纖維素酶活力減小，酶解反應速度降低[36]，從而導致茶籽油的得率降低。顯然，隨著溫度升高，茶籽油提取率呈先增加后減小的趨勢。當酶解溫度為40 ℃時，茶籽油收率達到最大值，因此40 ℃為最適酶解溫度。

2.1.5 反應pH值對茶籽油提取率的影響

給定條件：21 g茶籽粉，酶解溫度45 ℃，酶解時間75 min。加入80 mL(料液比1∶4)pH值分別為4.1、4.3、4.5、4.7、4.9檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液，纖維素酶0.038 g(60 U/茶籽粉g)，考察反應pH值對茶籽油提取率的影響，如圖5所示。

圖5 反應pH值對茶籽油提取率的影響

酶在最適pH值時擁有最高活力，但對不同的底物，同一種酶的最適pH值不一定相同。過高或過低的pH值會影響酶的空間結構，從而影響酶的活力[34]。本實驗所用纖維素酶的最適pH值為4～5。由圖5可知，當pH值在4.1～4.5時，隨著pH值的增大，茶籽油提取率逐漸增加，當pH值增至4.5時，茶籽油提取率最高。這可能是因為體系的pH值逐漸接近底物為油茶籽細胞纖維素時纖維素酶的最適pH值，因此纖維素酶活力升高，酶反應速度加快[37]。而當pH值在4.5～4.9時，隨著pH值的增大茶籽油收率逐漸減小，這可能因為此時體系的pH值高于底物為油茶籽細胞纖維素時纖維素酶的最適pH值，因此隨著pH值的增大，纖維素酶的活力逐漸減小。故體系pH 4.5時纖維素酶擁有其最大活力，茶籽油提取率最高。因此選擇pH 4.5為最佳pH值。

2.2 纖維素水酶法提取茶籽油的品質

纖維素酶解提取茶籽油的品質主要通過茶籽油的水分及揮發物含量、過氧化值、酸值三個指標考察，其結果見表1。

表1 茶籽油中水分及揮發物、過氧化值、酸值

由表1可知，纖維素酶處理得到的茶籽油原油過氧化值、酸值均低于國家標準GB/T 11765-2018[38](過氧化值≤7.5 mmol/kg，酸值≤4.0 mg/g)，說明茶籽油腐敗程度較低，油品較新鮮。但茶籽油中水分及揮發物含量高于國家標準GB/T 11765-2018(水分及揮發物(%)≤0.2)，說明通過離心分離茶籽油有較多水分及揮發物殘留，而水分及揮發物含量較高可能會導致茶籽油貯存期變短，同時可能影響茶籽油風味，因此纖維素水酶法提取的茶籽油還需要進一步的干燥處理。

2.3 酶種類對茶籽油成分的影響

纖維素酶水酶法提取茶籽油的GC圖譜如圖6所示。

圖6 纖維素酶水酶法提取茶籽油GC圖譜

由峰面積歸一[18,39]分析圖6，可得纖維素酶處理的茶籽油的中每種脂肪酸的相對含量，其結果見表2。

表2 茶籽油成分

由表2可知，纖維素酶提取的茶籽油中不飽和脂肪酸有6種，其中油酸含量最高，達到70.49%，不飽和脂肪酸總含量為76.74%，不飽和脂肪酸含量較高。由于單不飽和脂肪酸的植物油具有調節血脂，降血糖，保護心臟等生理功能[40]。這說明茶籽油具有較高的保健作用。

3 結 論

(1) 纖維素酶水酶法提取茶籽油時最佳條件為：酶解時間75 min，加入酶量為60 U/茶籽粉g，酶解時水浴溫度為45 ℃，料液比為1∶4，體系pH值為4.5(檸檬酸-磷酸二氫鈉緩沖液)，提取率最高約為18%。使用纖維素酶提取茶籽油使用的酶量較少，提取率較高。

(2) 茶籽油中油酸含量70.49%，不飽和脂肪酸總含量為76.74%，酸價和過氧化值均低于茶籽油原油國家標準。使用纖維素酶提取茶籽油成品油質量較好。但纖維素酶價格較為昂貴，為進一步降低成本，需要研究纖維素酶的回收和副產品的開發。