殼聚糖季銨鹽和皂土在黑莓果酒澄清中的應用

黃自蘇 周劍忠 李亞輝

摘要：采用L9（34）正交試驗研究殼聚糖季銨鹽（HACC）用量、皂土用量和澄清作用時間對黑莓果酒澄清效果和色度的影響，以果酒澄清度和色度為考核指標確定復合澄清劑澄清處理條件，并通過測定復合澄清劑澄清處理前后黑莓果酒中主要成分含量的變化和熱穩定性變化，研究復合澄清劑對黑莓果酒的澄清作用。結果表明，HACC用量 0.3 g/L、皂土用量0.1 g/L、作用時間3 d為最佳處理條件。在此條件下，復合澄清劑處理后，果酒中總糖含量、滴定酸含量、乙醇度、有效酸度等變化不顯著，總酚、花色苷和可溶性固形物含量變化顯著（P<0.05）。澄清處理之后，熱穩定性有較大提高。說明復合澄清劑是一種良好有效的黑莓果酒澄清劑。

關鍵詞：黑莓果酒;殼聚糖季銨鹽（HACC）;皂土;澄清度;熱穩定性;色度

中圖分類號： TS262.7 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）17-0210-03

羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖，俗稱殼聚糖季銨鹽（chitosan quaternary ammonium salt，HACC），是從海洋生物中提取的殼聚糖高級衍生物，一種強陽離子型高分子絮凝劑，無毒無害，其澄清機制是通過電中和與黏結架橋雙重作用，使溶液中的膠體等雜質絮凝沉降，一方面HACC利用自身所帶的大量正電荷與懸浮微粒及膠體所帶的負電荷相互作用，降低懸浮微粒及膠體表面電荷，使其絮凝脫穩;另一方面借助于高分子鏈的黏結架橋作用而產生絮凝。皂土（bentonite）也叫斑脫土，是火山灰分解成的一種黏土，在果酒的pH值條件下，帶有陰離子，具有較好地去除果酒中帶有陽離子蛋白的能力[1-4]，是國內外果酒釀造中常用的澄清劑[5-7]。

黑莓（Rubus alleghniensis）含有較高的酚類物質和花色苷，具有優良的抗氧化、抗癌等功能特性[8-9]，同時也富含鋅、硒等多種礦物質，氨基酸種類也很齊全，被譽為第3代“黃金水果”。由于黑莓為高酸型水果，口感不佳，但是有較強的加工屬性，黑莓汁、黑莓酒、黑莓醬是主要的加工產品[10-12]。

對于商品果酒來說，澄清度是決定品質的一個重要指標，澄清透明、顏色清亮的果酒商品容易吸引消費者的眼球。雖然研究表明渾濁或帶有沉淀的果酒對人體健康沒有影響，但影響消費者的購買欲，進而影響銷售市場。因此，果酒必須保持較高的澄清度和穩定性。本研究為解決發酵型黑莓果酒澄清的問題，借鑒前人的研究結果[13-14]，利用HACC和皂土作為復合澄清劑對黑莓果酒的澄清方法進行研究，旨在為黑莓酒的澄清方法提供技術支持和理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料、試劑與儀器

黑莓果酒由江蘇省農業科學院農產品加工研究所食品工程研究室在2017年1月采用黑莓果汁發酵釀造而成。黑莓由南京新得力食品有限公司提供，品種為赫爾。發酵菌種為釀酒酵母FM-S-115，由江蘇省農業科學院農產品加工研究所保存。澄清劑皂土和HACC購于南通綠神生物工程有限公司。

UV-1600 PC型紫外可見分光光度計，購自上海美譜達儀器有限公司;SK15臺式冷凍高速離心機，購自德國Sigma公司;LC-210.2精密電子天平，購自德國賽多利斯公司;WGZ-800濁度計，購上海昕瑞儀器儀表有限公司;WSC-S測色色差計，購自上海精科儀器有限公司;HI84532測定儀，購自意大利HANNA;數顯恒溫磁力攪拌器，購自江蘇省金壇市中正儀器制造有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 黑莓果酒釀造 按照以下工藝流程進行黑莓果酒釀造：

黑莓果→清洗→打漿→酶解→調配→發酵→過濾除渣。

1.2.2 澄清劑的配制 5%皂土懸浮液的配制：稱取5 g皂土，加入100 mL蒸餾水在50 ℃水浴中軟化，浸泡24 h，攪拌成均勻的漿體。

1% HACC懸浮液的配制：稱取1 g HACC，加入100 mL蒸餾水中，攪拌溶解成均勻的液體。

1.2.3 正交試驗 以HACC和皂土為復合澄清劑處理黑莓果酒，考察復合澄清劑中HACC和皂土的合適用量和二者之間適宜的配比，同時考察澄清時間對澄清效果的影響。以HACC、皂土用量和澄清作用時間作為正交試驗中的3個因素，以處理后果酒的濁度值和色度為響應值，選用L9（34）正交設計表進行試驗，以確定HACC和皂土復合澄清劑處理黑莓果酒的最優化條件，具體設計見表1。

1.2.4 濁度值測量 以蒸餾水調零，用標準溶液校對儀器，然后將澄清處理好的果酒倒入試樣瓶中，測其濁度值，具體操作步驟見儀器使用說明書。

1.2.5 色度的測量 將澄清處理好的果酒倒入比色皿中，以蒸餾水為參比，于420、520、620 nm處測其吸光度，以三者吸光度之和表示色度[15]。

1.2.6 熱穩定性測定 將澄清處理好的果酒取5 mL置于試管中，置于70 ℃水浴中處理6 h后，取出放置在4 ℃下16 h，然后在室溫下測定其在540 nm處的吸光度。以樣品熱處理后與熱處理前在540 nm處的吸光度差值表示穩定性[16]。

1.2.7 花色苷含量的測定-pH示差法[17] 取2個10 mL棕色容量瓶，加入1 mL蒸餾水，分別加入9 mL pH值1.0緩沖液（0.2 mol/L KCl與0.2 mol/L HCl以體積比為25 ∶ 67進行配制）和pH值4.5緩沖液（1 mol/L NaAc、1 mol/L HCl與H2O以體積比為100 ∶ 60 ∶ 90進行配制），搖勻，放置2 h，分別測定510、700 nm處的吸光度，作為對照組。測定樣品時，將黑莓果酒離心，取1 mL果酒上清液，用蒸餾水稀釋3倍后，按照上述步驟進行測定?；ㄉ蘸堪凑找韵鹿竭M行計算：

花色苷含量（mg/mL）=D×MW×F/（ε×l）。

式中：D=（D510 nm-D700 nm）pH值1.0-（D510nm-D700 nm）pH值4.5;MW為矢車菊素-3-葡萄糖苷分子量，取449.2;F為稀釋倍數;ε為矢車菊素-3-葡萄糖苷的摩爾消光系數，取 26 900;l為比色皿光程，1 cm。

1.2.8 總酚含量的測定（以沒食子酸計）-福林酚法（Folin-ciocalteu）[18] 配制質量濃度為0、5、10、15、25、50、100 mg/L的沒食子酸溶液，分別取1 mL于10 mL棕色容量瓶中，加入1.5 mL去離子水和0.5 mL Folin-ciocalteu試劑，搖勻后在1 min內加入20%（質量濃度）Na2CO3溶液 1.5 mL，搖勻后定容至10 mL，20～30 ℃暗處放置2 h，在波長 765 nm 處測定吸光度，以沒食子酸濃度為橫坐標，以吸光度為縱坐標繪制標準曲線。

果酒中總酚含量測定：取1 mL果酒，用蒸餾水稀釋100倍后按照上述步驟進行測定，根據標準曲線計算果酒中的總酚含量。

1.2.9 總酸度的測定 采用HI84532總酸測定儀進行測定，具體操作步驟參照儀器使用說明書。

1.2.10 可溶性固形物的測定 采用阿貝折光儀測定，具體操作步驟見儀器說明書。

1.2.11 乙醇度測定 采用蒸餾乙醇比重法[19]。

1.4 數據統計與分析

利用Excel 2003統計所有數據，利用SPSS 11.5軟件進行方差分析確定因素顯著性。

2 結果與分析

2.1 復合處理對黑莓果酒澄清度和色度的影響

為了獲得澄清度和穩定性較好的黑莓果酒，本研究選擇HACC和皂土作為黑莓果酒的復合澄清劑，分析HACC用量、皂土用量和澄清作用時間3個變量因素對黑莓果酒澄清度和色澤的影響。以澄清度和色度作為復合澄清劑處理黑莓果酒效果的考察指標，按照表1進行試驗，試驗結果及方差分析見表2。從表2中可以看出，3個因素對黑莓果酒澄清度的影響大小依次為HACC用量、皂土用量和澄清作用時間，最佳組合為A3B3C2。對黑莓果酒色度的影響大小依次為HACC用量、皂土用量和澄清作用時間，最佳組合為A1B1C1。復合澄清處理中各因素對澄清度的方差分析結果見表3，HACC用量對黑莓果酒的澄清度影響顯著（P<0.05），皂土用量和澄清作用時間對澄清度的影響不顯著。復合澄清處理中各因素對黑莓果酒色度的方差分析結果見表4，HACC用量對黑莓果酒的色度影響顯著（P<0.05），皂土用量和澄清作用時間對色度的影響不顯著。綜合表2、表3和表4的結果可以看出，HACC用量對澄清度、色度影響顯著，但在果酒的澄清處理中，除了考慮澄清效果，還要盡量保持果酒原有的色澤，綜合考慮澄清度和色度的處理效率，HACC用量選取A2;本復合澄清處理過程中，皂土用量對澄清度和色度的影響不顯著，取B1;澄清作用時間對澄清度和色度的影響都不顯著，同時考慮生產效率，取C1。綜合分析，本試驗較優條件為A2B1C1，即使用HACC用量0.3 g/L，皂土用量0.1 g/L，澄清作用時間為3 d。

2.2 驗證試驗

按照所得最優試驗條件進行黑莓果酒澄清處理，重復3次，進行驗證，澄清處理后黑莓果酒的濁度值為3.64，色度值為1.79。

2.3 澄清劑對黑莓果酒中主要成分的影響

黑莓果酒經復合澄清劑澄清處理后（HACC用量 0.3 g/L，皂土用量0.1 g/L，處理時間為3 d）， 果酒中的主要成分變化結果見表5。復合澄清劑處理前后，果酒中的總糖含量、乙醇度、滴定酸含量和有效酸度變化不顯著。但是澄清處理對果酒中的總酚含量、花色苷含量和可溶性固形物含量的影響顯著（P<0.05）。酚類物質是果酒中一類重要組分，其對果酒的感觀特性包括顏色、風味和口感等，具有重要貢獻，同時也是引起果酒沉淀的一類重要的非生物因素[20-22]。聚乙烯聚吡咯烷酮（PVPP）能夠吸附酚類物質，在釀酒工業上被作為澄清劑，能夠降低果酒的渾濁，這表明酚類化合物在果酒沉淀中扮演重要角色[23]。以上結果表明，復合澄清劑能夠很好地去除果酒中導致沉底的酚類物質，進而達到果酒澄清的目的。

2.4 澄清劑處理前后的熱穩定性

將經過復合澄清劑處理的黑莓果酒放置不同的時間，測定其熱穩定性，具體結果見表6。經復合澄清劑處理后的黑莓果酒的熱穩定性要明顯優于未經處理的，沒有經過澄清處理的黑莓果酒在熱處理（70 ℃）后，ΔD540 nm隨著時間的延長而增大。當儲存時間為12個月時，澄清處理后果酒的ΔD540 nm為0.002。Marangon等的研究表明，果酒經過熱處理之后，ΔD540 nm值小于0.02，則認為果酒的澄清度是穩定的，不會產生渾濁或沉淀[24]。由此可見，黑莓果酒經過HACC和皂土復合澄清處理后，能保持良好的澄清穩定性。

3 結論

復合澄清劑處理黑莓果酒的最佳處理條件為HACC用量0.3 g/L，皂土用量0.1 g/L，處理時間為3 d。經復合澄清處理后，果酒中的總糖含量、乙醇度、滴定酸含量和有效酸度變化不顯著，但是澄清處理對果酒中的總酚含量、花色苷含量和可溶性固形物含量的影響顯著（P<0.05）。HACC和皂土作為復合澄清劑處理黑莓果酒，能顯著提高果酒的熱穩定性，從而提高了果酒品質的穩定性。

參考文獻：

[1]Lambri M，Dordoni R，Silva A，et al. Effect of bentonite fining on odor-active compounds in two different white wine styles[J]. American Journal of Enology and Viticulture，2010，61（2）：225-233.