豬圓環病毒2型特異性納米抗體文庫的構建及鑒定

王長江，曲光剛,*，武曰星，管宇，魏鳳，侯運專，趙中偉，沈志強,*

(1.山東綠都生物科技有限公司，山東濱州 256600；2.山東省濱州畜牧獸醫研究院，山東濱州 256600；3.華中農業大學，武漢 43000)

豬圓環病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV2)屬于圓環病毒科圓環病毒屬，病毒粒子呈二十面體對稱結構，無囊膜，其基因組為單股環狀負鏈DNA[1]。PCV2是引起豬皮炎腎病綜合征、斷奶仔豬多系統衰竭綜合征和母豬繁殖障礙等相關綜合征的致病原[2-3]。PCV2和由它引發的疾病每年給養豬業造成巨大經濟損失，嚴重阻礙了我國養豬產業的發展[4-5]。因此，研制抗PCV2的特異性抗體對于探索PCV2的快速診斷及治療具有重要意義。

1993年，比利時學者Hamers-Casterman等報道駱駝中存在天然缺失輕鏈的重鏈抗體[6]，隨后發現在羊駝和一些軟骨魚等動物體內也存在類似的抗體[7-8]?？寺≈劓溈贵w的可變區可得到只由一個重鏈可變區構成的單域抗體(variable domain of heavy chain of heavy-chain antibody，VHH)[9]，由于VHH相對分子質量約為15 kD，僅為常規抗體的1/10，因此也被稱為納米抗體，它是目前天然來源的相對分子質量最小的抗體[10]。納米抗體由于其理化性質穩定[11]、易于基因操作和克隆[12]等優勢，在疾病診斷、分子檢測和治療等方面受到廣泛關注。目前納米抗體主要通過噬菌體展示技術獲得[13]，該技術通過PCR擴增出抗體的全套可變區基因，并將其克隆到噬菌粒載體上，利用E.coli構建包含納米抗體全部基因序列的抗體文庫；輔助噬菌體感染納米抗體文庫后釋放包含有重組噬菌粒的噬菌體，形成噬菌體抗體文庫，VHH表達在重組噬菌體表面，該技術將表型與基因型直接聯系在一起，將抗體識別抗原的能力與噬菌體擴增的能力結合在一起[14]，對特異性抗體的篩選更為高效；噬菌體抗體庫技術與雜交瘤單克隆抗體技術相比操作更為簡便，因此在生物技術領域極具應用前景[15]。本研究利用分子生物學技術構建了PCV2特異性納米抗體文庫，并對文庫相關指標進行了鑒定分析，為進一步研究篩選抗PCV2特異性納米抗體奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康成年羊駝1只，此前未經過任何主動免疫(山東綠都生物科技有限公司飼養)。

1.2 主要試劑E.coliTG1菌株、pCANTAB 5E載體由山東省濱州畜牧獸醫研究院購買保存；PCV2全病毒滅活疫苗由山東綠都生物科技有限公司提供；Ficoll-paque plus 購自GE公司；總RNA提取試劑盒(RNeasy Plus Mini Kit)和DNA純化回收試劑盒購自QIAGEN公司；反轉錄試劑盒為賽默飛公司產品；2×Taq PCR MasterMix 為天根公司產品；SfiI、NotI限制性內切酶、T4 DNA連接酶均購自NEB；瓊脂糖為Biowest產品；核酸提取試劑、甘油購自索萊寶生物科技有限公司；氨芐西林鈉、硫酸卡那霉素均購自Sigma公司；質粒提取試劑盒和膠回收試劑盒均為OMEGA公司產品；其他試劑均為進口或國產分析純。

1.3 引物設計 根據Maass和Harmsen等[9-10,16]文獻報道使用的引物并做適當修改，設計兩對特異性的引物擴增羊駝重鏈抗體基因片段。文庫構建及鑒定所用引物如表1所示。其中VHH1-F位于抗體編碼區的前導序列保守區，VHH1-R位于抗體CH2結構域高度保守區，該對引物用于擴增大小分別為900 bp的vh-CH1-CH2片段和約700 bp的vhh-CH2片段；VHH2-F和VHH2-R用于從700 bp的vhh-CH2片段中擴增得到約400 bp的羊駝重鏈抗體重鏈可變區vhh片段，兩對引物分別在抗體結構中的位置如圖1所示。VHH-Detc-F、VHH-Detc-R為pCANTAB 5E載體上的通用引物，用于文庫質量的PCR鑒定。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

表1 文庫構建及鑒定引物Tab 1 Primers used for library construction and characterization

圖1 vhh擴增引物在IgG抗體結構所在位置示意圖[17]Fig 1 Diagram of the location of vhh amplification primers in IgG antibody structure[17]

1.4 方法

1.4.1 羊駝免疫及外周血淋巴細胞分離 將PCV2全病毒滅活疫苗通過背部皮下多點注射的方式對羊駝進行免疫，共免疫4次，免疫間隔為14 d；每次免疫結束后跟蹤觀察注射包塊吸收情況以及羊駝健康狀態。第4次免疫結束后1周采血，采用ELISA方法檢測免疫抗體效價。通過頸部靜脈采集羊駝外周血20 mL，通過密度梯度離心方法分離外周血淋巴細胞，計數后直接用于提取總RNA，剩余細胞沉淀于-80 ℃凍存。

1.4.2 淋巴細胞總RNA提取及cDNA合成 使用QIAGEN總RNA提取試劑盒(RNeasy Plus Mini Kit)提取淋巴細胞總RNA，具體操作參照試劑盒說明書進行?？俁NA使用NanoDrop 2000測定濃度后，直接用于反轉錄合成第一鏈。

使用Thermo反轉錄試劑盒進行cDNA第一鏈合成，反應體系為：總RNA 2 μL、Oligo(dT)181 μL、nuclease-free water 9 μL；65 ℃ 5 min，然后立即在冰上冷卻；再向以上反應體系中加入5×Raction Buffer 4 μL、Ribolock RNase Inhibitor 1 μL、10 mmol/L dNTP Mix 2 μL、RevertAid M-MuLV RT 1 μL；42 ℃ 60 min，70 ℃ 5 min，10 ℃保存；反應結束后cDNA于-80 ℃保存或立即用于第一輪PCR反應。

1.4.3vhh基因擴增 利用巢式PCR通過兩輪PCR反應擴增羊駝重鏈抗體的可變區編碼基因，第一輪PCR反應以cDNA作為模板，使用VHH1-F和VHH1-R引物進行擴增反應，反應程序為94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s、50 ℃ 30 s、72 ℃ 50 s，30個循環，72 ℃ 10 min。反應產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后，切取約700 bp片段，使用OMEGA膠回收試劑盒回收純化目的片段。

第一輪PCR產物適當稀釋后作為第二輪PCR反應的模板，使用引物VHH2-F和VHH2-R進行擴增反應，反應條件為94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 50 s，30個循環，72 ℃ 10 min。使用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定目的條帶，預期條帶大小約400 bp。使用膠回收試劑盒回收純化目的條帶，于-20 ℃保存備用。

1.4.4 噬菌粒重組載體構建 將vhh目的基因片段與pCANTAB 5E噬菌粒載體分別使用SfiI和NotI限制性內切酶雙酶切，經瓊脂糖凝膠回收；使用T4DNA連接酶將純化的vhh目的基因片段與雙酶切處理后的噬菌粒載體pCANTAB 5E連接。將連接產物經電穿孔法轉入新制備的E.coliTG1感受態細胞中，電穿孔儀設置電壓為1.8 kV，電轉化完成后37 ℃ 200 r/min振蕩培養1 h，取100 μL進行梯度稀釋計算電轉化效率；剩余菌液涂布氨芐抗性固體平板，30 ℃過夜培養。

1.4.5 納米抗體文庫的庫容及多樣性鑒定 使用LB培養基沖洗平板上固化的菌落并收集到250 mL滅菌錐形瓶中，取100 μL菌液進行梯度稀釋后涂布氨芐抗性平板，過夜培養后計數各稀釋度平板上的菌落數，根據菌落數及稀釋倍數計算抗體文庫的庫容；隨機挑取50個單菌落分別于5 mL LB培養基中過夜培養，以過夜培養的菌液作為模板，使用VHH-Detc-F和VHH-Detc-R引物進行PCR反應，鑒定陽性克隆比例。將陽性克隆菌提取質粒后送上海生工生物工程有限公司測序，鑒定抗體文庫基因序列多樣性。剩余菌液加入終濃度為20%的甘油，混勻后分裝，于-80 ℃凍存。

2 結果與分析

2.1 PCV2滅活全病毒免疫羊駝后血清抗體效價

第4次免疫結束1周后采血分離抗血清，進行倍比稀釋，以PCV2 Cap蛋白包被ELISA 96孔板，以免疫PCV2全病毒滅活疫苗前分離的羊駝血清500倍稀釋后作為陰性對照，通過間接ELISA方法檢測免疫后羊駝血清IgG抗體水平。結果顯示，第4次免疫后，羊駝血清PCV2 IgG抗體效價可達1∶50000以上(圖2)，血清抗體水平符合構建納米抗體文庫標準。

圖2 PCV2滅活全病毒免疫羊駝后血清抗體效價Fig 2 Serum antibody level of alpaca after immunized with PCV2 inactivated virus

2.2 外周血淋巴細胞分離及總RNA提取 使用淋巴細胞分離液從20 mL羊駝抗凝外周血中分離到約7.5×107單個核細胞。使用QIAGEN總RNA提取試劑盒提取的RNA總量為25.9 μg，A260 nm/A280 nm值為1.99，滿足建庫要求。剩余淋巴細胞于-80 ℃凍存備用。

2.3vhh目的基因擴增 以制備的cDNA為模板，使用VHH1-F和VHH1-R引物進行第一輪PCR擴增反應，PCR產物使用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，結果見圖3。第一輪PCR產物包括大小分別為900 bp和700 bp的兩種特異性片段。

M: DL2000 Marker；ctrl: PCR陰性對照；1-2: 第一輪PCR產物 M: DL2000 Marker; ctrl: PCR negative control; 1-2: the first round PCR products圖3 第一輪PCR產物瓊脂糖凝膠電泳結果Fig 3 Agarose gel electrophoresis of the first round PCR products

割膠回收第一輪PCR產物中的700 bp片段，純化后以此為模板，使用VHH2-F和VHH2-R引物進行第二輪PCR擴增反應。瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，第二輪PCR產物大小約為400 bp(圖4)，與預期片段大小一致。

M: DL2000 Marker；N1～N2: PCR陰性對照； 1-2: 第二輪PCR產物 M: DL2000 Marker; N1～N2: PCR negative control; 1-2: the second round PCR products圖4 第二輪PCR產物瓊脂糖凝膠電泳結果Fig 4 Agarose gel electrophoresis of the second round PCR products

2.4 pCANTAB-vhh重組質粒構建 第二輪PCR產物經純化后與噬菌粒載體pCANTAB 5E分別經SfiI和NotI限制性內切酶雙酶切，使用DNA純化回收試劑盒回收雙酶切后的vhh目的片段和pCANTAB 5E載體，定量后使用T4 DNA連接酶連接過夜。連接產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果顯示連接產物包含大小分別為約7000 bp和5000 bp的兩條帶(圖5)。其中5000 bp條帶與重組質粒預期大小一致，可判斷vhh目的基因與pCANTAB 5E載體連接成功。

M: 1 kb ladder；1: 雙酶切后的pCANTAB 5E載體； 2: vhh與pCANTAB 5E連接產物 M: 1 kb ladder; 1: double-digested pCANTAB 5E vector; 2: ligation product圖5 連接產物瓊脂糖凝膠電泳結果Fig 5 Agarose gel electrophoresis of ligation product

2.5 納米抗體文庫陽性率、庫容鑒定 將連接產物通過電穿孔轉入新鮮制備的E.coliTG1感受態細胞中，電轉化后獲得轉化子數為1.34×108CFU/mL，轉化效率約1.5×108CFU/μg DNA。轉化子涂布氨芐抗性平板，30 ℃過夜培養后收獲平板上的菌落，最終收獲轉化重組子數為3.01×1010CFU/mL。從稀釋后菌液涂布的抗性平板上隨機挑取50個單菌落進行PCR鑒定，PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，結果顯示其中有4個為陰性(圖6，26號、29號、32號和43號)，其余均擴增出約700 bp的預期大小條帶(圖6)，陽性率為92.0%，計算最終庫容大小為2.77×1010CFU/mL。

M: DL2000 Marker；ctrl: PCR陰性對照；1-50: 菌液PCR結果 M: DL2000 Marker; ctrl: negative control; 1-50: PCR products of randomly picked colonies圖6 納米抗體文庫菌液PCR鑒定結果Fig 6 PCR identification results of nanobody library

2.6 納米抗體文庫多樣性鑒定 對鑒定為陽性的菌液提取質粒后測序，并將測序結果分別與NCBI數據庫進行BLAST比對分析，結果顯示所有匹配序列均為羊駝或駱駝重鏈抗體可變區序列，序列一致性比率在79%～97%之間，表明該抗體文庫為重鏈抗體基因文庫。測序序列之間比對結果如圖7所示，16個測序序列均為獨立克隆，其CDR3區的氨基酸種類和包含的氨基酸殘基數均有較大差異，表明該納米抗體文庫基因序列中CDR3區氨基酸序列種類豐富，所構建的PCV2納米抗體文庫具有很好的多樣性。其中編號為01、02、03和10的測序序列，CDR3區包含20個以上的氨基酸殘基，符合納米抗體具有較長CDR3區的典型特征；另外，所有測序序列的第39位、第46位、第47位和第49位氨基酸殘基種類符合納米抗體的氨基酸結構特征[18]，進一步證明了所構建的抗體文庫確為納米抗體文庫。

“.”表示該序列氨基酸與首行序列完全相同；“-”表示該位置氨基酸缺失；英文字母表示測序序列在該位置氨基酸殘基具有差異 “.” represents that the amino acids of all sequences in this site are the same; “-” represents that there are amino acids deletion in this site; Letters represent that the amino acids in this site are different圖7 納米抗體文庫序列多樣性分析Fig 7 Sequence diversity analysis of PCV2 nanobody library

3 討論與結論

PCV2是引起斷奶仔豬多系統衰竭綜合征等相關疾病的主要病原[19]，PCV2及其導致的多種病原體的共同感染每年給養豬業造成巨大經濟損失。目前雖已有各種類型的疫苗用于PCV2的防控，但是建立高效的PCV2感染的檢測方法對PCV2的綜合防控同樣具有重要意義。近年來已有許多國內外學者開展了PCV2單克隆抗體的研制工作[20-22]，與傳統多克隆抗體和單克隆抗體相比，納米抗體相對分子質量更小、特異性和穩定性好、制備周期相對較短、在識別傳統抗體無法識別的隱蔽表位或小表位等方面更具優勢。本研究構建了高質量納米抗體文庫，為篩選抗PCV2特異性納米抗體提供原始材料。

根據抗體基因來源動物是否經過免疫，納米抗體文庫可分為免疫抗體文庫和非免疫抗體文庫[23]，本研究構建的特異性納米抗體文庫來源于經PCV2免疫的羊駝，屬于免疫抗體文庫。動物免疫后血清抗體水平反映了特異性抗原激發免疫反應的程度，同時也能間接反映經特異性抗原介導活化、增殖的淋巴細胞的數目。本研究分離免疫羊駝外周血淋巴細胞后，通過巢式PCR擴增出vhh目的基因片段，并將其克隆到pCANTAB 5E載體上，連接產物瓊脂糖凝膠電泳結果出現兩條帶，推測是由于重組質粒的構象差異導致在凝膠中的遷移速率不同所致。

本研究所構建的納米抗體文庫，文庫菌陽性重組率為92.0%，符合納米抗體文庫質量要求；16個隨機測序序列均為獨立克隆，與NCBI數據庫進行BLAST比對分析，結果顯示目的基因均與羊駝或駱駝重鏈抗體重鏈可變區序列特征匹配，表明本研究所構建的抗體文庫為重鏈抗體基因文庫；在結構方面，納米抗體的典型特征之一是具有較長的CDR1和CDR3，CDR3平均長度為16～18個氨基酸[24-25]，較長的CDR3有助于維持納米抗體結構的穩定性、增加其特異性和親和力。與傳統抗體相比，納米抗體在FR2區存在4個特征性氨基酸，Phe/Tyr39、Glu/Gln46、Arg47和Gly/Phe/Leu49，這四個特征性氨基酸殘基能夠阻止VH與VL結合，增加納米抗體的可溶性、降低其聚合性[6, 25]。本研究中隨機挑取的16個單克隆的氨基酸序列符合納米抗體的氨基酸序列結構特征，納米抗體文庫包含序列多樣性良好。

納米抗體文庫的庫容大小、抗體基因多樣性是衡量抗體文庫質量的重要指標[26]，對后續淘洗出的特異性納米抗體的親和力具有決定作用[27]。對于天然抗體庫而言，淘洗到高親和力抗體(Kd10-8～10-10M)要求庫容達到109以上[28]；而免疫庫中包含的可變區基因是經過重排及親和力成熟后的序列，與非免疫抗體文庫相比，淘洗到高親和力納米抗體對庫容要求相對較低。本研究構建的納米抗體文庫庫容達到2.77×1010CFU/mL，文庫包含大量已經被誘導的PCV2特異性抗體基因，抗原針對性強，有助于淘洗到高親和力PCV2特異性納米抗體。

綜上所述，本研究成功構建了羊駝來源的PCV2特異性納米抗體文庫，并對文庫庫容和序列多樣性進行了鑒定，為進一步篩選抗PCV2相關抗原的高親和力納米抗體奠定了基礎。