響應面法優化瓊辣蓼總黃酮提取 工藝及其抗氧化活性研究

趙雅媚，盛琳，王寧，任守忠

(海南醫學院藥學院，海南省熱帶藥用植物研究開發重點實驗室，?？?571199)

辣蓼(PolygonumhydropiperLinn.) 為蓼科(Polygonaceae)蓼屬(Polygonum)植物辣蓼的干燥全草,具有除濕、殺蟲、祛風、化滯之功效[1]。研究表明，蓼屬植物的化學成分中均含有大量具有生物活性的次生代謝產物黃酮類化合物，能夠祛風利濕、止痛散瘀、消腫解毒，主要用于治療風濕寒性關節痛、腸胃炎、瘡疥、寒痢、腹瀉等疾病[2-3]。揮發油、黃酮類及萜類是辣蓼的主要成分，其中總黃酮的含量最高。張國英[4]利用系統預實驗方法對辣蓼的化學成分進行了檢測，主要有蘆丁、槲皮素、金絲桃苷、山柰酚、異鼠李素等5個黃酮類化合物，其有強抗氧化活性，清除人體內部自由基等作用[5]。隨著對黃酮研究的深入，從植物中提取分離總黃酮的方法己有大量文獻報道，但有關瓊辣蓼中黃酮類化合物的提取及工藝優化方面的文獻較少。

響應曲面設計方法是一種綜合試驗設計和數學建模的優化方法[6]，具有試驗次數少、精度高、預測值精準的優點，已廣泛應用于中醫藥領域[7-8]。但采用響應面法優化瓊辣蓼中總黃酮的回流提取工藝目前未見文獻報道。鑒于此，本實驗通過比較水提法和醇提法，根據其試驗結果采用較優的提取方法提取瓊辣蓼中的總黃酮，以提取液中總黃酮的百分含量為指標，通過單因素實驗考察乙醇體積分數、液料比、提取時間對總黃酮含量的影響，以響應面法對提取工藝進行優化，以期得到一種簡單、安全、高效的辣蓼中總黃酮的最佳提取工藝，并探討總黃酮體外抗氧化活性，為進一步拓寬瓊辣蓼總黃酮的開發利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 辣蓼經海南醫學院藥學院曾年開教授鑒定為瓊辣蓼，采自海南省昌江縣；蘆丁對照品購于海南詣高儀器有限公司；二苯基苦味?；诫?DPPH)，東京化成株式會社，>97.0%；谷胱甘肽(GSH)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，≥98%；2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)，上海麥克林生化科技有限公司，AR；水楊酸，硫酸亞鐵，濃過氧化氫等均為西隴科學股份有限公司；無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉等均為分析純，水為蒸餾水。

1.2 儀器 UV-1800PC 紫外分光光度儀(上海鳳凰光學科儀有限公司)；HC-150T2 型粉碎機(永康市綠可食品機械有限公司)；HH-2 數顯恒溫水浴箱(金壇市白塔新寶儀器廠)；ML-204 萬分之一天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)； RE-2000B型旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器有限公司)；DS-5510DTH超聲波清洗器(上海生析超聲儀器有限公司)

1.3 實驗方法

1.3.1 提取方法比較 準確稱取粉碎后的藥材粗粉5 g，共6份。其中三份蒸餾水回流提取，加入25倍量蒸餾水，水浴加熱回流提取30 min，放冷，過濾，濾渣分別再次加入10倍量蒸餾水繼續回流，重復兩次后抽濾，合并三次濾液，濾液收集于100 mL容量瓶中，最后定容至刻度；另三份乙醇回流提取，加入25倍量70%乙醇，水浴加熱回流提取30 min，放冷，過濾，濾渣分別再次加入10倍量70%乙醇繼續回流，重復兩次后抽濾，合并三次濾液，濾液收集于100 mL容量瓶中，最后定容至刻度。

1.3.2 總黃酮提取液制備 將辣蓼55 ℃干燥至恒重，粉碎，過 40目篩，準確稱取粗粉適量，加入適量乙醇，熱回流提取，過濾，濾渣加乙醇繼續回流提取，重復兩次，抽濾，合并三次濾液收集于100 mL容量瓶中，定容。

1.3.3 標準曲線制備 精密稱取蘆丁對照品10.0 mg，用60%乙醇超聲溶解，定容至50 mL，備用。分別吸取1. 0、2. 0、3. 0、4. 0、5.0 mL上述溶液，置于10 mL 量瓶中，采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉法顯色[9]，于510 nm 處測定吸光度。以吸光度值為縱坐標、蘆丁濃度為橫坐標繪制標準曲線。

1.3.4 總黃酮含量測定 精密量取1.3.1、1.3.2項下提取液適量，置10 mL量瓶中，按1.3.3項下方法依次加入5%亞硝酸鈉(NaNO2)、10%硝酸鋁、4%氫氧化鈉顯色，定容，于510 nm 處測定吸光度。根據標準曲線計算總黃酮的含量。

1.3.5 單因素試驗

1.3.5.1 乙醇體積分數的選擇 準確稱量藥材辣蓼粗粉3份于圓底燒瓶中，分別加入50倍量40%、50%、60%、70%乙醇，浸泡30 min，于80 ℃加熱回流提取30 min，放冷，過濾，藥渣分別再次加入20倍量40%、50%、60%、70%乙醇繼續回流提取，重復兩次后抽濾，合并三次濾液，濾液收集于100 mL容量瓶中，分別用40%、50%、60%、70%乙醇分多次洗滌，最后定容至刻度，搖勻。精密移取提取液溶液1.0 mL于10 mL容量瓶中，按1.3.3項方法測定吸光度，根據回歸方程，計算各提取液中總黃酮含量。

1.3.5.2 液料比的選擇 準確稱量藥材辣蓼粗粉3份于圓底燒瓶中，分別加入8、10、15、20倍量70%乙醇，浸泡30 min，于80 ℃水浴中加熱回流，分別提取30 min，放冷，過濾，濾渣分別再次加入8倍量70%乙醇繼續回流，重復兩次后抽濾，合并三次濾液，濾液收集于100 mL容量瓶中，用70%乙醇分多次洗滌，最后定容至刻度，搖勻。精密移取提取液溶液1.0 mL于10 mL容量瓶中，按1.3.3項方法測定吸光度，根據回歸方程，計算各提取液中總黃酮含量。

1.3.5.3 提取時間的選擇 準確稱量藥材辣蓼粗粉3份于圓底燒瓶中，分別加入50倍量70%乙醇(V/V)，于80 ℃水浴中加熱回流，分別提取120、90、60、30 min放冷，過濾，濾渣分別再次加入20倍量70%乙醇繼續回流，重復兩次后抽濾，合并三次濾液，濾液收集于100 mL容量瓶中，用70%乙醇分多次洗滌，最后定容至刻度，搖勻。精密移取提取液溶液1.0 mL于10 mL容量瓶中，按1.3.3項方法測定吸光度，根據回歸方程，計算各提取液中總黃酮含量。

1.3.6 提取工藝優化 在單因素實驗篩選的基礎上，對乙醇體積分數(A)、液料比(B)、提取時間(C)3個因素，每個因素選擇的 3 個水平，分別以-1、0、1 進行編碼。應用Design-Expert 8.0.6 軟件，選用Box-Behnken響應面設計模型，設計三因素三水平中心組合試驗條件，并對實驗結果進行響應面分析，確定最佳工藝條件(表1)。

表1 Box-Behnken試驗因素與水平Tab 1 Factors and levels of Box-Behnken

1.3.7 抗氧化活性

1.3.7.1 DPPH自由基的清除測定 分別向試管中加入不同濃度樣品溶液2 mL，再分別加入2 mL 0.06 mg/mL DPPH溶液，渦旋混勻，避光放置30 min，以無水乙醇代替DPPH，同法操作，作為空白調零，在517 nm處測吸光度值A1。以無水乙醇代替DPPH，同法操作，用無水乙醇調零，測其在517 nm處的吸光度值A0。2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)為陽性對照，平行測定3次。按下式計算DPPH自由基的清除率。

清除率=(A0-A1)/A0×100%。A1：樣品組吸光度值；A0：對照組吸光度值。

1.3.7.2 羥基自由基的清除測定 分別向試管中加入不同濃度樣品溶液1 mL，再依次加入0.3 mL 9 mmol/L的FeSO4溶液，0.3 mL 9 mmol/L的水楊酸-乙醇溶液，用去離子水補齊至6 mL，搖勻后加入0.3 mL 8.8 mmol/L的H2O2溶液啟動反應，在37 ℃保溫10 min，以去離子水代替H2O2溶液，同法操作，作為空白調零，在527 nm處測吸光值A1。以去離子水代替樣品溶液，同法操作，用去離子水調零，測527 nm處的吸光值A0。谷胱甘肽(GSH)為陽性對照，平行測定3次。按下式計算清除率。清除率=(A0-A1)/A0×100%。A1：樣品組吸光度值；A0：對照組吸光度值。

1.4 數據處理 用SPSS18.0軟件進行數據分析，繪圖采用Origin 8.5軟件，響應面分析用Design-Expert 8.0.6軟件。

2 結果與分析

2.1 提取方法結果比較 由圖1可知，醇提法提取液中的總黃酮百分含量，可達到5.014%，明顯高于水提法的1.923%，醇提法的提取效果更好。因此，以下研究采用醇提法。

圖1 提取方法對總黃酮含量的影響Fig 1 Effects of extracting method on total flavonoids content

2.2 單因素實驗結果

2.2.1 乙醇體積分數對黃酮提取率的影響 由圖2可知，當乙醇體積分數由40%升高至50%時，提取液中總黃酮的提取率逐漸增加，當繼續升高到60%時，提取效果反而下降。因此，選擇乙醇體積分數為50%作為響應面法優化試驗的中心點。

2.2.2 液料比對黃酮提取率的影響 由圖3可知，隨著液料比倍數的增加，辣蓼中總黃酮的提取率逐漸提高，當液料比為1∶15時，總黃酮的提取率達到最大值，之后隨液料比增大而下降。因此，考慮到提取率和節約溶劑減少損耗兩方面的因素，選擇液料比1∶15作為響應面試驗優化試驗的中心點。

2.2.3 提取時間對黃酮提取率的影響 由圖4可知，在 30～60 min內，隨著提取時間的延長，辣蓼總黃酮提取率逐漸升高；提取時間超過60 min后，繼續延長提取時間，提取率變化不顯著，且黃酮類化合物長時間處于高溫環境下，易被氧化破壞。因此，提取時間以60 min作為響應面試驗優化試驗的中心點。

圖2 乙醇體積分數對瓊辣蓼總黃酮提取率影響Fig 2 Effects of Ethanol concentration on extraction rate of flavonoids

圖3 料液比對瓊辣蓼總黃酮提取率的影響Fig 3 Effects of Solid-liquid ratio on extraction rate of flavonoids

圖4 提取時間對瓊辣蓼總黃酮提取率的影響Fig 4 Effects of Ethanol?time on extraction rate of flavonoids

2.3 響應面實驗結果

2.3.1 響應面實驗結果與分析 以瓊辣蓼中總黃酮得率為響應值，經回歸擬合后，得到如下回歸方程：Y=9.25-0.12×A+0.32×B+0.52×C-0.47×AB+0.36×AC+0.10 ×BC-0.52×A2-0.23×B2+0.14×C2，對方程進行方差分析，結果見表2～表3。

表2 Box-Behnken試驗結果Tab 2 Box-Behnken experiment result

表3 方差分析Tab 3 Analysis of variance

由表3可知，模型的P=0.024<0.05，差異顯著，表明該模型擬合度良好，得到的回歸方程能較好地反映各指標與各因素之間的關系。模型的失擬項的P≥0.05，說明失擬項不顯著，可利用此模型來分析和預測乙醇回流提取辣蓼中的總黃酮含量[10]。從方差分析結果可以看出，方程中的B，AB對瓊辣蓼總黃酮提取的影響是顯著的(P<0.05)，說明B因素與A因素對總黃酮提取含量的影響是有交互作用而不是簡單線性關系；方程中C對瓊辣蓼總黃酮的提取影響是極顯著的(P≤0.01)。A，AC，BC，B2,C2對瓊辣蓼總黃酮提取的影響不顯著。因此，可以得出各因素對總黃酮提取率影響的大小順序為：提取時間(C)>料液比(B)>乙醇體積分數(A)。

通過Design-Expert 8.0.6軟件分析，由響應面及回歸方程可得出瓊辣蓼黃酮類成分的最優提取工藝條件為：乙醇體積分數為47.79%，液料比為15倍，提取時間為60 min，提取總黃酮百分含量預測值為10.120%?？紤]到實際實驗過程中的可操作性，將優化條件修正為：乙醇體積分數48%，液料比15倍，提取時間60 min。

2.3.2 最優工藝的驗證 按照修正后的工藝條件，進行驗證試驗(n=3)，所得提取總黃酮的百分含量為10.101%，與預測值接近，結果表明，該工藝穩定可行。

2.4 抗氧化活性

2.4.1 DPPH自由基清除能力 瓊辣蓼總黃酮對DPPH自由基的清除作用如圖5所示，從圖5可知，在實驗設置的濃度范圍內瓊辣蓼總黃酮對DPPH自由基的清除能力隨濃度增加而增大，IC50為0.46 mg/mL，但清除率低于BHT，其對DPPH自由基的清除能力為BHT的7.8%。

2.4.2 羥基自由基清除能力 瓊辣蓼總黃酮對羥基自由基清除作用如圖6所示，從圖6可以看出，在1～5 mg/mL濃度范圍內，隨濃度增加，清除能力增強，IC50為2.95 mg/mL，其對羥基自由基的清除能力優于GSH。

圖5 總黃酮對DPPH自由基的清除率Fig 5 Scavenging capacity to DPPH free radical of flavonoids

圖6 總黃酮對羥基自由基的清除率Fig 6 Scavenging capacity to hydroxyl radical of flavonoids

3 討論與結論

辣蓼中主要活性成分為黃酮類成分，其中，蘆丁、槲皮苷、異鼠李素等為辣蓼中含量最多的黃酮類物質。辣蓼總黃酮提取方法有浸漬法、索氏提取法、滲漉法、加熱回流法、超聲法等，不同提取方法各有優缺點，目前，超聲法和熱回流法是最常用的兩種提取方法。羅文涓[11]等采用水煎醇沉法、浸提法、超聲法、超聲酶解法進行辣蓼總黃酮的提取，結果表明，超聲法能耗低、黃酮得率高，優于其他方法。而向蓉[12]等采用熱水、超聲、加熱回流、索氏法分別對辣蓼總黃酮進行提取，其中超聲法和熱回流法總黃酮得率相差不大，都明顯高于熱水和索氏法。超聲提取雖能耗低，但不適用于大量藥材提取，而熱回流提取法不借助儀器，操作簡單，既可用于少量藥材提取，也可用于大量藥材提取，是較為理想辣蓼總黃酮的提取方法，所以本次研究選用乙醇熱回流提取。

從辣蓼中提取黃酮類成分是后續進一步研究的基礎，而優化提取工藝是提高辣蓼中黃酮類成分提取率的關鍵。本實驗采用乙醇熱回流法對瓊辣蓼總黃酮進行提取，在單因素的基礎上，利用響應面法建立了瓊辣蓼中總黃酮提取工藝條件的二次多項數學模型，探討了乙醇體積分數、液料比、提取時間對總黃酮提取含量的影響。結果表明：影響提取率的因素大小為提取時間>料液比>乙醇濃度，與文獻一致[13-14]，經分析獲得了最佳提取條件為：料液比1∶15，乙醇濃度48%，提取時間60 min時，總黃酮提取率為10.101%。在此條件下，總黃酮的提取率高于部分文獻報道超聲提取法[15]，這可能與藥材產地、采收月份及選用部位等不同也有一定關系，何立美等報道辣蓼的產地、采收不同，其黃酮含量及類型差異很大[16]。辣蓼總黃酮具有一定抗氧化作用，體外抗氧化活性評價試驗結果表明瓊辣蓼總黃酮對1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基和羥基自由基都有清除作用，且呈現出明顯的量效關系，樣品濃度越高，清除自由基的能力較強，清除率IC50分別為0.46 mg/mL和2.95 mg/mL，其對羥基自由基的清除能力優于谷胱甘肽。本研究所優化的提取工藝簡便，穩定，可行，提取率高，且所提取的總黃酮具有抗氧化活性，為瓊辣蓼總黃酮的提取及抗氧化應用提供實驗依據。