2016-2018年吉林地區豬流行性腹瀉仔豬小腸組織滅活液免疫效果研究

沙萬里, 閆滿，叢薇，劉東旭，尹柏雙，李國江*

(1.吉林農業科技學院，吉林吉林 132101；2.吉林省預防獸醫學重點實驗室，吉林吉林132101； 3.永吉縣動物疫病預防控制中心，吉林吉林132100)

豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea, PED)是導致仔豬腹瀉死亡的主要原因之一，2012 -2017年全國各地區呈爆發趨勢且防治效果不明顯[1]。PED最明顯特點是3～7日齡新生仔豬高發，臨床表現為嚴重腹瀉、嘔吐、脫水，是致死率極高的腸道傳染病[2]。由于豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)為有囊膜不分節段單股正鏈RNA的結構特點[3]，研究發現S基因存在核苷酸插入與缺失及氨基酸突變、ORF3基因存在氨基酸變異[4-5]。部分地區PEDV流行株調查情況顯示，國內大部分流行株親緣關系較近，與疫苗株CV777、中國早期分離株CH/S、韓國流行株DR13、泰國流行株TH/AY/2.7/12、日本株14JM/01等親緣關系較遠[6]，這可能是導致疫苗免疫效果不佳、PED暴發流行的主要原因。本研究通過PEDV膠體金試紙、RT-PCR檢測及臨床癥狀與病理剖檢相結合作為診斷方法，通過篩陽性樣本制備小腸組織滅活液，與原使用疫苗對比，評價免疫效果，為進一步驗證PEDV流行株的遺傳變異和分析PED的暴發流行及提供緊急防治措施提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品來源及實驗動物 樣品來自2016年1月-2018年5月間，分布在吉林市、永吉、樺甸、舒蘭、蛟河、磐石地區3～7日齡仔豬發生嚴重腹瀉、嘔吐、脫水和死亡的30個豬場150份完整腸道樣本，保存于吉林農業科技學院(吉林省豬生態養殖及疫病防控科技創新中心)-80 ℃冰箱；清潔級昆白鼠30只；產前90 d妊娠母豬72頭(校企合作產學研基地PEDV陽性場)。

1.2 主要試劑 PEDV膠體金檢測卡(韓國金諾)、組織DNA/RNA基因組通提試劑盒(日本TaKaRa9766)、反轉錄試劑盒(TaKaRa 6210A)、EX Tap聚合酶(日本TaKaRa)、瓊脂糖(西班牙BIOWEST)；PDEV ELISA抗體檢測試劑盒(北京飛凱)、50×TAE(北京博奧拓達)、0.9%生理鹽水、0.4%甲醛、雙抗、LB培養基等均為國產化學試劑。

1.3 PEDV膠體金試紙檢測 將病料置于4 ℃條件下解凍，用棉簽采集腸內容物放入PEDV檢測樣品稀釋管(含稀釋液)中充分混勻，吸取上清液4～5滴至試紙條加樣孔中，室溫條件下5 min內觀察結果。判定標準：C處出現紅色條帶檢測卡有效，T處出現紅色線條帶判定PED陽性。

1.4 PEDV RT-PCR檢測

1.4.1 引物設計 參考 GenBank 中公布的 PEDV CV777 毒株全基因序列(登錄號為 AF353511)，通過軟件設計1對引物用于擴增ORF3基因，將其命名為PED-ORF3U1/L1，目的擴增基因片段長度為792 bp，引物由博仕生物技術有限公司合成，引物信息見表1。

表1 PEDV CV777 ORF3引物信息Tab 1 Primer information of PEDV CV777 ORF3

1.4.2 病毒RNA提取與cDNA合成 將保存的病料反復凍融(解凍條件為4 ℃)三次，取小腸組織及內容物20 mg，按照TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0方法提取樣品總RNA，置于-80 ℃保存。cDNA 的合成體系：Primescript RT Enzyme Mix 1 μL、RT Primer Mix 1 μL、5×Primescript Buffer 4 μL、RNase Free ddH2O 4 μL、總RNA產物10 μL，最終總體系為20 μL，37 ℃孵育15 min。獲得的cDNA模板置于-80 ℃保存。

1.4.3 RT-PCR擴增 以合成的cDNA模板進行PDEV ORF3基因擴增，根據引物設計預期基因片段長度為792 bp。PCR反應體系：Premix Taq DNA酶12.5 μL、PEDV-ORF3 U1 2 μL、PEDV-ORF3 L1 2 μL、cDNA模板2.5 μL、ddH2O 6 μL，反應總體系為25 μL。擴增反應條件：45 ℃ 30 min，95 ℃ 2 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35 個循環；72 ℃ 5 min，4 ℃ forever。取擴增產物3 μL上樣3%瓊脂糖凝膠孔，電泳電壓條件150 V。

1.5 小腸組織滅活液免疫效果分析

1.5.1 抗原滅活 按照病料來源分類，選取PEDV雙鑒定法陽性病料整段小腸及內容物，按照病料重量與無菌生理鹽水(0 ℃預冷)1∶10比例5000 r/min勻漿，16層紗布無菌條件下過濾3次，0.4%比例加入甲醛充分混勻，37 ℃轉瓶滅活48 h，按1500 UI/mL體積比加入雙抗液(青霉素和鏈霉素)混勻，分裝后-20 ℃保存備用。取上述滅活液5 μL分別接種LB固、液培養基，37 ℃ 48 h進行無菌檢驗。以0.5 mL、1.5 mL、3 mL劑量分別注射5只昆白鼠，同劑量生理鹽水注射組為對照，進行安全性評估。

1.5.2 免疫效果分析 選取3個防控無明顯效果且準備進行返飼的校企合作產學研基地PEDV陽性場，依次命名為A、B、C，24頭/場，每組12頭：a1-12原疫苗組、b1-12組織滅液組。分別于產前70 d、35 d后海穴注射4 mL/頭，產前2 d采集靜脈血，分離血清-20 ℃保存。參照PDEV ELISA抗體檢測試劑盒說明書進行抗體水平測定，結果判定：OD陽性對照≥0.4試驗有效，臨界值=0.3*OD陽性對照，OD樣本≥臨界值為陽性。新生仔豬發病率=(發病數/同組總頭數)×100%、新生仔豬死亡率=(死亡數/同組總頭數)×100%。

2 結果與分析

2.1 PEDV檢測結果 結合臨床和病理剖檢(圖1)、PEDV膠體金試紙及RT-PCR檢測結果綜合判定。在試紙卡中C、T位置出現紅色條帶證明PEDV陽性(圖2)，RT-PCR擴增產物經凝膠電泳在792 bp處出現條帶證明PEDV陽性(圖3)。疑似PEDV感染場采樣統計數據見表2，吉林、永吉、舒蘭、磐石、蛟河、樺甸場陽性率依次為100%、100%、80%、80%、80%、60%，樣本陽性率依次為92%、84%、68%、76%、76%、56%，總體場陽性率76%，總體樣本陽性率75%。

圖1 臨床癥狀與病理剖檢結果Fig 1 Clinical symptoms and pathological examination results

C：檢測對照線；T：樣本檢測線 C: Test control line; T: Sample line圖2 PEDV膠體金試紙檢測結果Fig 2 Detection results of PEDV colloidal gold dipstick

M: DNA Marker DL 2000；1-6：檢測樣本 M: DNA Marker DL 2000；1-6：Test sample圖3 PEDV膠體金試紙檢測結果Fig 3 Detection results of PEDV colloidal gold dipstick

表2 疑似PEDV感染場檢測結果數據統計Tab 2 Statistics of detection results of suspected PEDV infection field

2.2 PDEV ELISA抗體檢測結果 抗體檢測結果如表3所示，三個試驗場組織滅活液組抗體平均值、標準差、陽性率均高于原疫苗組，而A場和C場離散度高于原疫苗組、B場低于原疫苗組，總體數據折線圖(圖4)表明，組織滅活液組抗體平均水平高于原疫苗組。

表3 PEDV ELISA抗體檢測結果Tab 3 Results of antibody detection by PEDV ELISA

圖4 PEDV總體抗體水平趨勢Fig 4 All trend of antibody level of PEDV

2.3 預防效果 使用來源于各自養殖場內病料制備的小腸組織滅活液與原疫苗免疫進行對比分析，統計數據表明(表4)，A場發病率從68.5%下降到8.5%，死亡率從60.1%下降到8.5%；B場發病率從71.4%下降到16.1%，死亡率從68.3%下降到16.1%；C場發病率從58.7%下降到7.7%，死亡率從53.1%下降到7.7%。

表4 新生仔豬發病率、死亡率Tab 4 Morbidity and mortality of newborn piglets

3 討論與結論

仔豬感染PEDV在診斷過程中需要綜合考慮各種因素。RT-PCR是目前普遍采用的一種分子生物學檢測技術，具有快速、靈敏、特異等優點，但是通過復檢各地區部分檢測結果時，假陰、陽性的問題一直存在，在該流程中人為操作、主觀判斷、核酸污染等均可影響結果準確性。目前，膠體金試紙技術非常成熟，在應用過程中具有簡便、快速、直觀等優勢，但與RT-PCR檢測結果復核時也存在一定差別。PED臨床癥狀和病理變化[7]較為典型，在此基礎上結合上述檢測方法，可提高PED臨床診斷準確性，實現及時預警，可有效防控PED流行與爆發，減少養殖企業經濟損失。

全國各地區PEDV流行毒株與參考毒株ORF3和S基因同源性與系統進化研究結果表明，S基因存在核苷酸缺失、變異及突變，毒株之間存在部分差異[8-9]，與本研究中抗體檢測結果相互驗證，解釋了應用參考株疫苗雖然產生了抗體，但達不到預期免疫保護效果，而免疫滅活液卻效果顯著這一問題。

本試驗制備的免疫滅活液是自家苗的一種，具有高度同源性，解決了血清型不同和病原變異這一主要矛盾。當某些種類疫病爆發且無有效防治方法時，自家苗可作為一種緊急防治措施控制疫情。但值得注意的是，雖然臨時使用自家苗起到了明顯的防治效果，相對于返飼又具有較好的生物安全性，但是自家苗的病毒效價、注射劑量、免疫麻痹、含多種抗原導致的免疫應激、非目標病原以及雜質廢物等對機體的負面影響是需要慎重考慮的。建議在疫病防控中通過基因型比對等方法及時配型，使用標準化商用疫苗實現疫情的有效防控。

本研究結果表明，針對爆發PED且無有效防治效果，應用來源于場內小腸組織病料重量與無菌生理鹽水(0 ℃預冷)1∶10比例、0.4%甲醛滅活48 h、1500 UI/mL雙抗制備的滅活液產前70 d、35 d后海穴注射4 mL/頭免疫妊娠母豬，可作為緊急防治措施有效防控PED疫情。