懸浮MDCK細胞源與雞胚源H9亞型 禽流感疫苗免疫效力比較研究

習碩，趙蕾，史愛華，章振華，李林，沈佳，崔麗娜，姜北宇，張建偉

(北京市農林科學院畜牧獸醫研究所,北京 100097)

禽流感病毒(Avian influenza virus, AIV)是嚴重危害家禽和野禽的一種烈性傳染性病原，根據其臨床致病性差異，將其分為高致病性禽流感病毒(highly pathogenic avian influenza virus，HPAIV)和低致病性禽流感病毒(low pathogenic avian influenza virus, LPAIV)[1]。其中，H9N2亞型低致病性禽流感病毒(LPAIV)感染禽類雖然引起的死亡率較低、臨床癥狀較輕，但仍然是威脅我國養禽業的重要病原之一[2]。H9 AIV不僅廣泛存在于活禽市場，還可以感染人[3-4]。有報道表明，目前流行的H9 AIV可以作為基因供體，為多種流感病毒提供內部基因與其他亞型病毒重排，給新型流感病毒在人群中的大規模流行埋下了隱患[5]。通過疫苗免疫接種預防禽流感仍然是現今采用的主要手段。值得注意的是，近年來H9 AIV的變異現象時有發生，其中2011-2014年H9 VIA的變異速度是1999-2005年的10.64倍[6]。然而，AIV抗原大多利用非免疫雞胚制備，病毒在雞胚中的傳代是造成AIV基因變異的主要原因之一[7-8]；其次，禽流感流行需要大量疫苗時，有可能存在雞胚供應不足的問題；同時，制苗用雞胚的來源不明，也有造成外源病毒污染的可能[9]。與傳統雞胚制苗方法比較，動物懸浮細胞制備疫苗具有細胞來源和背景清晰，不含有外源病毒的優點，病毒抗原穩定，批間差異小，易于擴大和大規模生產等優點。許多學者比較了MDCK貼壁細胞制備的人流感疫苗與雞胚源疫苗的效果，認為兩種疫苗有著相當的免疫效果[10-12]。為了探討和驗證由北京市農林科學院畜牧獸醫研究所純懸浮馴化的MDCK細胞制備H9亞型AIV抗原疫苗免疫效力，進行了MDCK細胞源疫苗和雞胚源H9亞型AIV疫苗的比較試驗，現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 MDCK懸浮細胞株(MDCK-sus)由北京市農林科學院畜牧獸醫研究所免疫與預防研究室購自中國獸醫藥品監察所的MDCK貼壁細胞自行馴化獲得，懸浮細胞批號為20190520，代次為MDCK-sus F10。

1.1.2 病毒株 制苗毒株：H9亞型AIV BX13株由北京市農林科學院畜牧獸醫研究所免疫預防研究室2013年從北京某雞場分離、純化及鑒定，毒株代號為A/Chicken/Beijing/BX/13(H9N2)株(BX13)。制苗毒株為H9亞型AIV BX13株1-E3，批號：20170523，毒價為107.7EID50/0.1mL。攻毒毒株為H9亞型AIV BX13株1-E1，批號：20170411，毒價為108.7EID50/0.1mL。

1.1.3 雞胚 SPF雞胚購自北京勃林格殷格翰維通生物技術有限公司，在本研究室孵化至10日齡，用于毒種繁殖，毒價測定及攻毒后的分毒試驗。

1.1.4 試驗動物 21日齡SPF雞購自北京勃林格殷格翰維通生物技術有限公司，北京市農林科學院畜牧獸醫研究所SPF雞舍飼養。

1.1.5 HI抗原 HI工作抗原由本研究室制備，H9亞型AIV BX13株1-E3，批號：20170425，HA效價為29，使用時按照1∶128配制4HA工作抗原。

1.1.6 雞紅細胞懸液 1%雞紅血球由本研究室采集成年公雞血液制備，用于收獲的病毒液HA和試驗雞的血清HI抗體測定。

1.1.7 主要試劑與耗材 無血清培養基MS01購自蘇州市沃美生物技術有限公司；250 mL三角瓶購自Corning公司。

1.1.8 儀器設備 細胞搖床購自上海一恒科技有限公司；倒置顯微鏡購自上海光學儀器廠；血球計數板購自上海市求精生化試劑儀器有限公司；2L生物反應器BioFlo?/CelliGen?115購自美國NBS公司。

1.2 方法

1.2.1 疫苗制備 分別制備雞胚源和MDCK純懸浮細胞源疫苗。雞胚源疫苗抗原制備方法為取10萬倍稀釋的AIV BX13制苗毒株，接種10日齡SPF雞胚，每胚0.1 mL, 密封針孔，置37 ℃孵育，每24 h照蛋，棄去24 h內死亡雞胚，收獲24 h～120 h內死胚和120 h時活胚的雞胚尿囊液，測定其HA和EID50，用作制備雞胚源疫苗抗原。

MDCK細胞源疫苗抗原制備方法為將2L生物反應器進行清洗、安裝、高壓滅菌后冷卻備用，取生長到一定密度的細胞，使用無血清MS01培養基制備成密度為2.0×106/mL ～2.5×106/mL的細胞懸液1L，以感染復數(MOI)0.01接種H9亞型禽流感病毒BX13株，同時按照3.5 μg/mL的終濃度加入TPCK-Trypsin，將以上細胞-病毒混合液加入到生物反應器中，設置生物反應器參數，溶氧DO為40%，pH 7.2，溫度33 ℃，攪拌速度60 r/min, 收獲培養72 h的抗原液，測定其HA和EID50，用作制備細胞源疫苗抗原。

疫苗制備方法為首先分別將2種抗原液加入終濃度為2 mL/L的甲醛溶液，置37 ℃恒溫搖床內滅活24 h。經滅活檢驗合格后取上述2種滅活抗原液，分別制備雞胚源抗原水相和細胞源抗原水相，同時制備油相，以油相∶水相比為2∶1的比例乳化制成油包水型滅活疫苗，配苗時收獲抗原液的病毒滴度均為107.7EID50/0.1mL。

1.2.2 疫苗物理性狀檢驗 外觀：應為白色均勻乳劑。劑型：取一清潔吸管，吸取少量疫苗滴于冷水中，除第1滴外，均應不擴散。穩定性：吸取疫苗10 mL加入離心管中，以3500 r/min離心15 min, 管底析出水相應不超過0.5 mL。粘度：按現行《中國獸藥典》附錄進行檢驗，應符合規定。無菌檢驗：按現行《中國獸藥典》進行，應無菌生長。

1.2.3 免疫試驗分組與免疫接種 90只21日齡SPF雞隨機分為9組，A1～A4組每組10只雞，分別胸肌注射雞胚源滅活疫苗，注射劑量為0.3、0.2、0.1、0.02 mL/只(107.7EID50/只、107.5EID50/只、107.2EID50/只、106.5EID50/只)；B1～B4組每組10只，分別胸肌注射MDCK懸浮源滅活疫苗，注射劑量為0.3、0.2、0.1、0.02 mL/只(107.7EID50/只、107.5EID50/只、107.2EID50/只、106.5EID50/只)；C組5只雞，不免疫接種，用于攻毒對照；D組5只雞為健康對照。

1.2.4 試驗雞HI抗體檢測 各組雞均在免疫接種后7 d、14 d、21 d翅靜脈采血、分離血清，待檢測AIV HI抗體。

1.2.5 攻毒試驗 免疫后21 d采血后，A1～A4, B1～B4，C組雞分別翅靜脈注射100倍稀釋的AIV BX13攻毒毒株, 每只0.5 mL(病毒含量107.4EID50), D組5只雞不做任何處理，為健康對照。

1.2.6 分毒試驗 試驗雞攻毒后第3天，分別采集每只雞的咽拭子和泄殖腔拭子，置于裝有0.8mL生理鹽水(含青、鏈霉素雙抗1萬單位，pH 7.2)的eppendorf管中，渦旋振蕩混勻后，3000 r/min離心5 min, 取同一只雞的咽拭子和泄殖腔拭子上清液混合作為1個樣品，尿囊腔接種5枚10日齡SPF雞胚，0.2 mL/胚。接種后定期照蛋，棄去24 h內死亡雞胚，收獲72～120 h死亡雞胚尿囊液，分別測定HA價，至120 h, 按照分組分別收獲活胚尿囊液，測定HA價。若同一只雞的樣品接種的5枚雞胚中有1枚雞胚的HA價≥4log2,該樣品判定為分毒陽性。若接種樣品的5枚雞胚均為陰性，取5枚雞胚尿囊液的混合液再接種5枚10齡SPF雞胚進行盲傳，最終確定樣品的分毒結果。

2 結果與分析

2.1 疫苗制備 參照《中國獸藥典》有關雞禽流感疫苗的檢驗方法，對2種疫苗的試驗室制品進行了物理性狀和無菌檢驗，結果見表1。

表1 AIV BX13株雞胚源疫苗與MDCK細胞源疫苗物理性狀和無菌檢驗Tab 1 Physical characters and sterility test of AIV BX13 strain of the two vaccines

2.2 血清HI抗體消長規律 不同源和劑量疫苗免疫后7 d、14 d、21 d各組雞的血清HI抗體，結果見表2。免疫前隨機抽取90只21日齡試驗雞中10只，測定其AIV HI抗體水平均為陰性。以不同免疫劑量的雞胚源疫苗和MDCK細胞源疫苗免疫21日齡SPF雞后7 d，AIV HI抗體水平為0log2；免后14 d和21 d, 兩種疫苗免疫雞的HI抗體滴度隨著免疫時間的增加而提高，同時也隨著免疫劑量的增加而提高，兩種疫苗免疫接種后21 d的 HI抗體也較免疫后7 d、14 d顯著提高。MDCK細胞源疫苗免疫組與雞胚源疫苗組均在免疫后21 d產生了更高水平的HI抗體。攻毒前攻毒對照組和健康對照組試驗雞HI 抗體均為陰性。

表2 禽流感BX13株不同源疫苗和劑量免疫后抗體消長規律Tab 2 Growth and decline of AIV BX13 HI titer after different source vaccines and doses of immunization

HI抗體單位log2

2.3 攻毒試驗結果 攻毒保護試驗結果見表3。攻毒試驗結果顯示，雞胚源疫苗和細胞源疫苗免疫接種后21 d，用與制苗株同源的H9亞型 AIV BX13株翅靜脈攻毒，雞胚源疫苗免疫雞的接種劑量為0.1 mL/只雞(107.2EID50/只)以上時，試驗雞的攻毒保護率達到100%；MDCK細胞源疫苗免疫雞的免疫劑量為0.2 mL/只雞(107.5EID50/只)以上時，試驗雞的攻毒保護率達到100%。攻毒對照雞均100%分毒陽性，健康對照雞分毒陰性。

表3 2種滅活疫苗不同免疫接種劑量的攻毒試驗結果Tab 3 The challenge results of the 2 vaccines with different immune doses

攻毒試驗結果：陽性數/攻毒數(健康對照除外))

2.4 抗體水平與分毒陽性率的關系 抗體水平與分毒率關系結果分別見表4和表5。雞胚源疫苗免疫后，3只AIV HI抗體為0log2～3log2的試驗雞均分毒陽性，5只AIV HI 抗體4log2～5log2的試驗雞均毒陰性， 7只AIV HI抗體為6的試驗雞1只分毒陽性，25只AIV HI 抗體為7log2～11log2的試驗雞，分毒陽性率為0，試驗雞均保護；MDCK細胞源疫苗免疫組，3只AIV HI抗體水平為0log2～3log2的試驗雞分毒陽性，9只AIV HI 抗體為4log2、5log2、6log2的試驗雞5只病毒分離陽性，12只AIV HI抗體為7log2的雞1只分毒陽性，16只AIV HI抗體水平為8log2～10log2的試驗雞均未分離到病毒，100%保護。

表4 雞胚源疫苗免疫后抗體水平與攻毒保護率的關系Tab 4 The relationship of AIV HI titer to the protection rate after chicken embryo-derived vaccine immunization

表5 MDCK細胞源疫苗免疫后抗體水平與保護率的關系Tab 5 The relationship of AIV HI titer to the protection rate after cell-derived vaccine immunization

3 討論與結論

本研究分別采用雞胚培養的方式和純懸浮培養MDCK細胞的方式制備了2種H9亞型AIV BX13株滅活疫苗，以不同劑量(0.02、0.1、0.2和0.3 mL/只)免疫接種21日齡SPF雞后兩種疫苗均能誘發雞只產生AIV HI抗體，免疫雞的AIV HI抗體水平均隨著免疫劑量的增加而提高。2種疫苗免疫后7 d均未檢測到AIV HI抗體，免疫后14 d最高免疫劑量組雞胚源疫苗免疫雞的AIV HI抗體滴度最高達到3.6log2，MDCK細胞源疫苗AIV HI抗體滴度最高達到4.6log2，細胞源疫苗組稍高。免疫后21 d，兩種疫苗免疫雞的AIV HI抗體水平明顯高于免后14 d,結果說明免疫時間和AIV HI抗體水平呈正相關。當免疫劑量為0.1～0.3 mL/只時，雞胚源疫苗的抗體水平為7.0log2～8.8log2，細胞源疫苗的抗體水平為7.2log2～8.3log2。張建偉等[13]使用微載體懸浮培養MDCK細胞制備禽流感病毒疫苗，證明MDCK細胞制備的禽流感病毒疫苗具有較好的免疫效果，使用不同劑量接種21日齡SPF雞，免后21 d HI抗體水平最高為5.6log2，如果以免疫后抗體水平評價免疫效果，與本研究對比，免疫劑量相同時，純懸浮細胞源疫苗免疫效果明顯高于貼壁培養的MDCK細胞源疫苗。

攻毒試驗結果顯示，本研究中相同免疫劑量時，雞胚源疫苗的保護效果高于純懸浮MDCK細胞制備的H9亞型AIV疫苗，雞胚源病毒液制備的疫苗以0.1 mL/只(107.2EID50/只)劑量免疫就可以達到100%保護；細胞源病毒液制備的疫苗抗原以0.1 mL/只(107.2EID50/只)劑量免疫保護率為80%，當免疫劑量達到0.2～0.3 mL/只(107.5EID50/只～107.7EID50/只)時，保護率達到100%，說明當免疫劑量為0.2 mL/只(107.5EID50/只)以上時，雞胚源疫苗和MDCK細胞源疫苗的攻毒保護率無顯著差異。免疫劑量相同時，雞胚源疫苗免疫效果高于細胞源疫苗的原因尚不清楚，筆者認為有以下幾種原因，病毒在MDCK細胞中傳代是否會導致病毒變異，抗原液中的MDCK細胞組分是否影響雞的免疫應答，是否存在試驗雞只的個體差異等都有待進一步試驗證實和深入研究。

鮮有學者針對使用懸浮MDCK細胞制備禽流感疫苗免疫雞后產生的抗體水平與分毒陽性率的關系做過比較，本試驗分析了2種疫苗免疫試驗雞后21 d，HI抗體滴度與分毒陽性率之間的關系。當使用雞胚源疫苗免疫時，15只AIV HI抗體水平為0log2～6log2的試驗雞有4只分毒陽性，其中1只AIV HI為6log2也分毒陽性，因此不排除抗體水平為4log2～6log2雞只感染AIV后向環境排毒的風險，當AIV HI抗體水平為7log2～11log2時，所有免疫雞均未分離到病毒，說明使用雞胚源抗原制備H9亞型AIV BX13株疫苗免疫試驗雞，當HI抗體滴度達到7log2時，即可阻止雞只排毒。當使用MDCK細胞源疫苗免疫時，24只AIV HI抗體水平為0log2～7log2的試驗雞中9只分毒陽性，其中4只AIV HI抗體水平為6log2～7log2的試驗雞病毒分離陽性，說明細胞源疫苗的免疫效力可能稍低于雞胚源疫苗，是疫苗本身的原因還是試驗雞只的個體原因尚待進一步確認，當細胞源疫苗免疫雞的AIV HI抗體水平達到8log2以上時，雞只停止向外排毒，說明該抗體水平可以有效抑制病毒的排放。綜上所述，抗體水平與排毒有明顯相關性，雞胚苗源疫苗的AIV HI抗體滴度達到7log2，細胞苗源疫苗的AIV HI達到8log2時均可抑制病毒排放，本研究由于統計數量較少，也由于雞只個體間存在差異，結論尚需更多數據驗證。

本研究顯示，如果用攻毒保護率評價疫苗的免疫效果，細胞苗與雞胚苗尚有差異，但差異不大，通過進一步篩選對AIV敏感的細胞株和改進培養工藝，或許可以獲得高產細胞株和高毒價的抗原，通過提高毒價獲得與雞胚苗一致的保護率的疫苗是可能的。

本研究的目的是找到一種能夠替代雞胚制備AIV疫苗抗原的方法，有學者研究發現，AIV在MDCK懸浮細胞上的增殖能力與MDCK貼壁細胞相當，可獲得較高的病毒滴度，但貼壁細胞增殖病毒工藝復雜，同一批次細胞瓶中的病毒滴度也存在差異[14]。因此，懸浮培養細胞增殖AIV成為了研究熱點。本研究采用純懸浮的MDCK細胞接種AIV制備抗原和疫苗，通過AIV HI抗體檢測和攻毒試驗證明純懸浮培養方式制備的AIV疫苗具有較好的免疫效果，使用該疫苗免疫SPF雞，0.1 mL/只以上的免疫劑量免疫SPF雞后21 d，抗體水平達到7.2log2～8.3log2, 0.2 mL/只的免疫劑量即可保護100%的雞不向外界排毒，證明懸浮培養MDCK細胞制備的禽流感疫苗免疫效力確實可靠。本研究的結果為后續繼續篩選對AIV增殖效率更高的MDCK細胞株和利用純懸浮培養MDCK細胞制備AIV疫苗抗原奠定了基礎。