用凍干菌液進行豬丹毒、多殺性巴氏桿菌病 二聯滅活疫苗效力檢驗的研究

邵慶紅，邢佳鵬，朱文革，張連祥，方鵬飛

(北京華信農威生物科技有限公司，北京 102209)

豬丹毒病是由豬丹毒桿菌引起豬的一種烈性傳染病，發現較早，分布十分廣泛，世界各大洲凡養豬地區幾乎都有發生豬丹毒病的報道，給養豬業造成很大損失。我國是養豬大國，過去認為豬丹毒主要發生在南方各地，但近些年東北、華北、西北等北方地區發病也較多。這主要是因為近些年對病毒病的重視，忽視了細菌病的防控，往往復雜的豬病情況和不良環境導致豬免疫力下降，給豬丹毒桿菌有機可乘。豬多殺性巴氏桿菌病與豬丹毒病類似，均屬條件致病菌，在正常條件下不會導致豬發病，但在環境比較差，如悶熱、寒冷、潮濕、營養缺乏、密度過大等不良條件下，導致機體免疫力下降，就會使病原繁殖，從而引起發病[1]。

疫苗接種是預防兩種病發生的有效的方法。目前，市場上有減毒活疫苗、滅活疫苗，皆有良好的免疫效果。豬丹毒、多殺性巴氏桿菌病二聯滅活疫苗因使用安全、易于保存、對母源抗體的影響不敏感、不受抗生素的影響且可聯合免疫，得到廣泛的認可[2]。

效力檢驗是評價豬丹毒、多殺性巴氏桿菌病二聯滅活疫苗保護效果的關鍵參數。此產品的效力檢驗需要進行動物攻毒試驗，在以往的檢驗中，質檢室一直使用新鮮菌液進行攻毒試驗。這就需要在檢驗工作中進行大量的前期準備工作，如培養基配制、菌液繁殖、活菌計數、最小致死量確定等等，檢驗程序繁瑣，工作量大。新鮮菌液一般在效力檢驗攻毒前7 d制備完畢，在進行攻毒試驗之前攻毒用菌液置于2～8 ℃冷藏狀態中保存，但活菌數隨著時間的延長而逐漸下降，從而會影響最終檢驗結果的準確性，而將菌液凍干更易于長期保存，也能減少檢驗人員的工作量[3]。本研究就凍干保存的攻毒菌與新鮮菌液進行攻毒對比試驗，并對凍干菌進行保存期驗證，以期能將新鮮的攻毒菌液凍干保存用于產品的攻毒保護試驗。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 疫苗 豬丹毒、多殺性巴氏桿菌病二聯滅活疫苗，由北京華信農威生物科技有限公司生產，批號為183602、183603，規格為20 mL/瓶，物理性狀檢驗和安全檢驗及其他檢驗項目均合格。

1.1.2 攻毒用菌種 豬丹毒桿菌1型C43-8株(CVCC 43008)和2型C43-6株(CVCC 43006)、多殺性巴氏桿菌C44-8株(CVCC 44408)強毒菌液，基礎菌種購自中國獸醫藥品監察所，由北京華信農威生物科技有限公司質檢室自繁并鑒定合格，20%甘油，-70 ℃保存。其中，C43-6株、C43-8株同比例混合進行豬丹毒部分的效力檢驗，C44-8株進行豬多殺性巴氏桿菌病部分的效力檢驗。

1.1.3 培養基 馬丁肉湯，購自中海生物科技有限公司；裂解血細胞全血，購自北京平睿生物科技有限公司。

1.1.4 凍干保護劑 5%蔗糖脫脂牛奶凍干保護劑，由北京華信農威生物科技有限公司質檢室自制，經116 ℃、15 min高壓滅菌處理。

1.1.5 試驗動物 16～18 g清潔級小鼠，昆明系，雄性，76只，購自斯貝福(北京)生物技術有限公司；體重1.5～2.0 kg普通級兔，日本大耳白，性別不限，20只，購自北京金牧陽實驗動物養殖有限責任公司。

1.1.6 小型冷凍干燥機 LABCONCO。

1.2 方法及判定標準

1.2.1 豬丹毒部分的效力檢驗 每批疫苗用體重16～18 g小鼠32只，分為凍干菌組和新鮮菌液組，每組設有免疫1組和免疫2組，同時設空白不免疫對照1組和對照2組。小鼠皮下接種疫苗21 d后，各免疫組和對照組分別用相應的豬丹毒桿菌混合菌液進行攻毒。攻毒后觀察10 d，每組注射1000 MLD(Minimum Lethal Dose，最小致死量，簡寫MLD)的對照小鼠應全部死亡，注射1 MLD的對照小鼠至少死亡2只，免疫小鼠應至少保護7只[4]。具體免疫方案和攻毒劑量見表1。

表1 豬丹毒部分效力檢驗Tab 1 The detection of swine erysipelas

肩標*表示此組小鼠皮下注射4倍稀釋的疫苗，即1份疫苗加3份40%氫氧化鋁膠生理鹽水的混合液

1.2.2 豬多殺性巴氏桿菌病部分的效力檢驗 每批疫苗用體重1.5～2.0 kg兔12只，分為凍干菌組和新鮮菌液組，每組設有免疫組和空白不免疫對照組。在疫苗接種21 d后，各免疫組和對照組分別用相應的C44-8株菌液進行攻毒，皮下注射80～100 CFU(Colony-Forming Units，菌落形成單位，簡寫CFU)。攻毒后觀察8 d，對照組兔應全部死亡，免疫組兔應至少保護2只[4]。具體免疫方案和攻毒劑量見表2。

表2 豬多殺性巴氏桿菌病部分效力檢驗Tab 2 The detection of Pasteurella multocida

1.2.3 新鮮菌液的繁殖 馬丁肉湯培養基按配方進行配制，分裝量為200 mL/瓶，按要求進行滅菌。在滅菌合格的馬丁肉湯中加入0.5%的裂解血細胞全血混勻，分別按照1.5%的比例加入C43-6株、C43-8株、C44-8株三種甘油凍存菌，在37 ℃搖床培養5～6 h，手搖菌液呈明顯的云霧狀停止培養。

1.2.4 新鮮菌液的保存及凍干 將停止培養的三種菌液各取出100 mL，分別加入適宜比例的蔗糖牛奶保護劑混勻分裝至7 mL管制瓶，2.2 mL/瓶，放入凍干機進行21～22 h的冷凍真空干燥，置于-70 ℃保存。將剩余的菌液置2～8 ℃冰箱冷藏保存。

1.2.5 活菌計數

1.2.5.1 新鮮菌液的活菌計數 將停止培養的菌液用馬丁肉湯進行倍比稀釋，選擇合適稀釋度，平鋪法活菌計數，并多次復核最終確定攻毒前活菌數。

1.2.5.2 凍干菌的活菌計數 將經冷凍真空干燥的凍干菌用1 mL馬丁肉湯進行復原，并進行倍比稀釋，選擇合適稀釋度，平鋪法活菌計數，并多次復核最終確定攻毒前活菌數。

1.2.6 豬丹毒桿菌最小致死量的測定 根據新鮮菌和凍干菌的活菌數，分別將C43-6和C43-8按活菌數進行同比例混合，選擇不同的菌數劑量進行小鼠攻毒試驗，能使小鼠死亡的最小活菌數為豬丹毒桿菌對小鼠的最小致死量。

1.2.7 凍干菌種保存期驗證試驗 將凍干的豬丹毒桿菌和豬多殺性巴氏桿菌自凍干日期起保存2個月、4個月、6個月、8個月、10個月、12個月分別進行活菌計數，監測凍干菌在保存過程中的衰減情況。

2 結果與分析

2.1 豬丹毒桿菌最小致死量 將2～8 ℃保存豬丹毒桿菌的新鮮混合菌液和-70 ℃保存的凍干混合菌種分別選擇4個劑量注射小鼠，小鼠死亡情況見表3?？梢?，新鮮菌液的小鼠MLD為3.2 CFU，凍干菌種的小鼠MLD為6.7 CFU。

表3 豬丹毒桿菌混合菌液的小鼠最小致死量Tab 3 Minimum lethal dose in mice with erysipelas mixture

2.2 活菌計數 由于新鮮菌液在停止培養7～10 d內進行活菌計數和MLD的計算且細菌的活菌計數只是一個相對值，故從表4的數據可以看出豬丹毒桿菌和豬多殺性巴氏桿菌新鮮菌液在攻毒前和攻毒時的活菌數雖有差異但并不顯著。另外，凍干菌種活菌計數需要用適宜培養基復融不易再次保存，攻毒前和攻毒后也只是復核活菌數，故沒有進行攻毒后的活菌數對比。表5數據表明凍干后的菌種在-70 ℃保存一年細菌計數結果穩定。

表4 活菌計數Tab 4 Live bacterial count

表5 凍干菌種保存期驗證試驗Tab 5 Test of lyophilized bacteria preservation period

2.3 攻毒保護試驗結果

2.3.1 豬丹毒部分效力檢驗攻毒保護結果 兩批疫苗的豬丹毒部分效力檢驗分別用新鮮菌液和凍干菌種進行小鼠攻毒試驗，詳細數據見表6。新鮮菌液組注射1 MLD劑量的對照組2小鼠全部死亡，注射1 000 MLD劑量的對照組1的小鼠全部死亡，183602批免疫組小鼠有9/10只保護，183603批免疫組的小鼠有8/10只保護。凍干菌液組注射1 MLD劑量的對照組2的小鼠全部死亡，1000 MLD劑量的對照組1的小鼠全部死亡，183602批免疫組的小鼠有10/10只保護，183603批免疫組小鼠有10/10只保護。

表6 兩批豬丹毒部分效力檢驗Tab 6 The detection of swine erysipelas

肩標*表示以攻毒時活菌計數的量計算，單位是CFU

2.3.2 豬多殺性巴氏桿菌病部分效力檢驗攻毒保護結果 兩批疫苗的豬多殺性巴氏桿菌病部分效力檢驗分別用新鮮菌液和凍干菌液進行兔子攻毒試驗，詳細數據見表7。新鮮菌液組對照組兔2/2死亡，183602批免疫組兔子3/4保護，183603批免疫組兔子2/4保護。凍干菌液組對照組兔2/2死亡，183602批免疫組兔3/4保護，183603批免疫組兔子3/4保護。

從表7數據看出新鮮菌液和凍干菌種的攻毒劑量基本一致，這是由于此產品檢驗標準規定為攻含活菌80～100 CFU，而C44-8對兔的最小致死量至多為10 CFU[5]，故豬多殺性巴氏桿菌病部分效力檢驗部分無論新鮮菌液還是凍干菌種攻毒用活菌數都控制在90 CFU左右。

表7 兩批豬多殺性巴氏桿菌病部分效力檢驗Tab 7 The detection of Pasteurella multocida

肩標*表示以攻毒時活菌計數的量計算，單位是CFU

3 討論與結論

新鮮菌液在冷藏狀態中細菌活性逐漸衰減，最佳保存時間僅為一周左右，而凍干菌種在12個月的監測期內活菌計數結果穩定，更易于長期保存[6-8]，故利用凍干菌進行攻毒試驗在保證攻毒菌數準確的前提下，避免了每個批次的產品檢驗都進行菌種繁殖、重復計數復核等工作，也降低了攻毒失敗的風險，簡化檢驗操作，提高工作效率，是值得推行的方法。

凍干菌種相對新鮮菌液有一定優勢，但凍干過程可能會影響細菌體內部分酶的活性，降低細菌的活力和致病性[9-10]，導致最小致死劑量會發生變化，因此應定期對凍干菌種的毒力進行監測，外加實驗動物的個體差異，每次攻毒前應當測定凍干菌種對實驗動物的最小致死劑量。

此研究利用兩批產品的效力檢驗進行了凍干菌種和新鮮菌液的攻毒試驗對比，凍干菌種在試驗中能夠達到新鮮菌液同等的檢驗結果。另外在長期保存過程中凍干保存的菌種活菌數穩定，可以保證對照組死亡，檢驗成立。初步說明將攻毒用菌液進行凍干保存用于豬丹毒、多殺性巴氏桿菌病二聯滅活疫苗效檢攻毒試驗是可行的。