人類鼻病毒在哮喘患者氣道重塑中的作用機制及臨床意義

譚漫琳 李樹鈞

在健康的個體中，人類鼻病毒（Human rhinovirus，HRV）感染是普通感冒主要的原因，然而，在支氣管哮喘（哮喘）患者中，HRV 感染可以對疾病的發生和發展產生重大影響。哮喘是一種常見的慢性氣道炎癥性疾病，具有明顯的異質性和復雜的病理生理特征。在幼年時期，HRV 誘發的喘息性疾病是哮喘后續發展的一個重要危險因素，越來越多的證據表明，反復HRV 感染在哮喘氣道重塑多個方面的發生發展中起著重要的作用。近年來，哮喘病死率有所下降，但發病率仍不斷上升，且至今尚無有效治愈的方法，不易控制的重癥哮喘是致命性過敏反應的危險因素，哮喘急性發作給全球的衛生保健系統帶來了巨大的經濟負擔，成為哮喘患者住院和死亡的主要原因。眾多研究發現，HRV 感染是哮喘急性發作常見的誘因之一。因此，更好地了解HRV 在哮喘中的作用顯得尤為重要。過去十余年的研究對HRV 感染所致哮喘患者氣道重塑的發生發展有了新的認識，現就目前關于HRV 感染在哮喘發生及氣道重塑中的作用機制加以綜述，并提出相關治療策略，以限制HRV 感染對哮喘的影響。

一、HRV 分類

HRV 是一種單股正鏈RNA 病毒，基因組約7 200 個bp，被蛋白質衣殼包裹，其病毒蛋白（virus protein，VP）分別是VPl、VP2、VP3 和VP4。VPl、VP2 及VP3 位于病毒顆粒表面，而VP4 位于內部并掩藏病毒核酸。HRV 屬于病毒科，腸道病毒屬，根據其病毒殼蛋白核苷酸序列分為3 型：HRV-A、HRV-B 和HRV-C。HRV-A、HRV-B 分別含74、25 個亞型，余下的屬于自2009 年后才確認的HRV-C［1］。HRV 也可根據其結合受體分類，其中88 種HRV-A、HRV-B 通過與細胞間黏附分子-1（ICAM-1）受體黏附到細胞表面，11 種HRV-A 與極低密度脂蛋白受體相結合入侵機體［1-2］，HRV-C 主要感染纖毛氣道上皮細胞，哮喘易感基因產物鈣黏蛋白相關家族成員3（CDHR3）可以介導HRV-C 的結合和復制，CDHR3 主要在纖毛氣道上皮細胞表達，調節CDHR3 表達或纖毛細胞分化的因子可能影響對HRV-C 的易感性［3-4］。研究表明，5 歲以下與HRV-C 感染相關的急性哮喘患兒中，男性患兒中度／重度惡化的幾率顯著增加［5］，而住院成年哮喘患者疾病嚴重程度則與HRV 類型無關，但總的來說，無論是何種亞型，HRV 感染與哮喘的發生發展、急性加重聯系緊密［6］。

二、HRV 感染與哮喘發生發展的關系

病毒性呼吸道感染所致喘息性疾病的致病原（尤其是HRV）和嚴重程度可以顯著預測高危人群的哮喘發展，與沒有喘息性疾病的人相比，在3 歲以內有HRV 誘導喘息性疾病的兒童哮喘發病率為9.8%［7］。很少有報道描述病毒性呼吸道感染在成人患者哮喘急性發作中的重要性，但Takeshi等［8］的研究首次表明，各種呼吸道病毒如HRV，hMPV，Inf-V和RSV 與成人患者的哮喘發作有關，且HRV-A 和HRV-C 具有廣泛的遺傳差異性，具有季節性變化，HRV 是秋季哮喘發作的常見原因。也有研究表明，上呼吸道病毒感染所致哮喘急性發作者，患兒高達85%，成年人大約50%，在這些研究檢測到的病毒中，HRV 占60%，是主要的病原體［9］。Yutaka等［10］也有報道，通過實時PCR 技術檢測成人支氣管哮喘急性發作感染性病原體，流感嗜血桿菌為最常檢測到的微生物（26.6%），其次為HRV（15.6%）。另外，?hrmalm 等［11］研究了一項無感染癥狀的穩定型哮喘患者與健康人群的對照實驗（納入研究人員年齡為10 歲～35 歲），采用PCR 分析鼻咽吸出物中常見呼吸道病毒RNA 的存在情況，顯示HRV 是唯一檢測到的病毒（哮喘患者4.5%，對照組0.9%），并提示HRV 似乎在哮喘和空氣過敏原IgE 致敏的青年人氣道中更普遍。

1.HRV 感染與遺傳背景：基因-環境的相互作用被認為是哮喘發展的關鍵環節，全基因組關聯研究已經確定了一些與哮喘進展相關的候選基因和基因位點，譬如17q21 位點的變異可以影響GSDMB 和ORMDL3 基因的表達，在HRV 誘導喘息性哮喘疾病過程中這兩種基因表達水平增加，GSDMB基因特異位點的純合子單核苷酸多態性可使存在HRV 感染史的人群哮喘風險增加26 倍［12-13］。一項特定哮喘表型的全基因組關聯研究發現新的易感基因CDHR3 在氣道上皮高表達，是早期兒童哮喘急性發作的易感位點，其單核苷酸多態性導致529 位置的半胱氨酸殘基突變為酪氨酸殘基，與HRV的結合及子代數量增加和哮喘患者病情加重有關［14］，日本一項關于成人候選基因的兩獨立樣本病例對照研究也顯示，CDHR3 變異是嚴重成人哮喘的重要易感因素，與以特應性、早發性和低肺功能為特征的哮喘表型有顯著關聯性［15］。

2.HRV 感染與過敏反應：過敏反應和病毒誘導喘息都是哮喘發展的獨立危險因素，在一個高危的新生兒隊列研究中，馬爾科夫模型顯示，過敏反應增加了后續病毒誘導喘息的風險［16］，一項基于陽性家族史的兒童哮喘隊列研究表明，早期的HRV 感染可使患哮喘的風險增加10 倍，提示在有陽性家族史的兒童群體中，早期HRV 感染和哮喘的發生密切相關［13］。

3.HRV 感染與哮喘氣道重塑的關系：哮喘患者呼吸道的特征性結構變化，統稱為氣道重塑。這些變化包括網狀基底膜增厚、平滑肌增生、血管生成及上皮表型轉變等，這些變化會縮小氣道管腔并導致氣道壁增厚，被認為是氣道高反應性的發展和持續的基礎［17］，早期氣道上皮網狀基底膜增厚、嗜酸性粒細胞和輔助（CD4）淋巴細胞浸潤是哮喘的特征性改變，重型哮喘患者氣道壁明顯增厚，其氣管壁炎性分泌物和黏液混合后所致支氣管阻塞是患者死亡的主要原因［18］。傳統認為氣道重塑發生在多年的慢性氣道炎癥，最近對患有新發呼吸道癥狀的學齡前兒童進行的支氣管活檢研究表明，即使在確診哮喘之前，也存在氣道重塑的特征，如網狀基底膜增厚、嗜酸性粒細胞浸潤及氣道平滑肌增生，這暗示著氣道重塑與炎癥同步發生［19-20］。許多研究表明HRV 可通過很多方面影響氣道重塑，如下所述：

（1）增加黏蛋白MUC5AC 基因的表達：氣道黏液分泌過多是哮喘的重要病理生理特征，黏蛋白是氣道黏液的主要成分，MUC5AC 主要分布在細胞質或液泡膜中，哮喘患者MUC5AC 基因表達增加，氣道上皮杯狀細胞數量隨之增加，分泌過多黏蛋白，其在短時間內大量進入呼吸道，可能導致嚴重氣道阻塞，氣道阻力增加，甚至導致患者死亡［21-22］。HRV 感染人體后，人體通過模式識別受體TLR3 特異性識別病毒，多種表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）配體的轉錄激活，隨后EGF 通過自分泌／旁分泌激活細胞外信號調節激酶（extracellular signal regulated protein kinase，EKR），EKR 進入細胞核后誘導MUC5AC 基因表達增加，氣道黏液黏蛋白含量隨之增加，其信號傳導過程為HRV→NK-κB（核因子-κB）→MMP（基質金屬蛋白酶）→TGF-ɑ（轉錄生長因子ɑ）→EGFR→MAPK（絲裂原活化蛋白激酶）→ERK →Sp1（特異性蛋白1）→MUC5AC 基因→MUC5AC 黏蛋白［23-24］。

（2）減少緊密連接的表達：肺內部環境與外界物質的交界面由多種類型細胞構成的假復層黏膜屏障構成，一系列連接復合物包括緊密連接、粘附連接、間隙連接、橋粒和連接蛋白維持這種保護屏障，緊密連接通常位于相鄰上皮細胞的頂端，調節離子和溶質的選擇性通過，防止病原體及其產物進入肺間質。Looi 等［25］的研究首次證明了在HRV 感染后緊密連接蛋白表達改變與上皮功能受損之間的直接關聯，影響大分子物質通透性。claudin-1、occludin、ZO-1 是緊密連接的重要組成蛋白，在HRV 感染后，哮喘患者的氣道上皮細胞中claudin-1 和occludin mRNA 明顯增加，但claudin-1，occludin 和ZO-1 蛋白表達顯著降低，這種轉錄與表達的不平衡性原因尚不清楚，可能與多種因素有關，如多效轉錄抑制因子Snail，其參與轉錄后過程，導致claudin-1 蛋白合成減少。確定的是，HRV 感染導致緊密連接解離，從而導致哮喘患者氣道上皮細胞通透性增加和上皮抗性喪失，大分子物質通透性增加提示，HRV 感染有助于過敏原或病原體穿過上皮細胞，促進其與氣道內部環境的相互作用，從而進一步加重氣道炎癥和結構重塑［26］。

（3）促進平滑肌增厚及上皮下纖維化：①腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）超家族成員14（TNFSF14），也稱為LIGHT 或CD258，是過敏原誘發的嚴重哮喘模型中氣道重塑的強大驅動力，肺泡上皮細胞和中性粒細胞是LIGHT 的潛在來源，Mehta 等［27］進行了一項HRV 多次感染小鼠評估氣道重塑的實驗，結果證明，反復HRV 感染可誘導小鼠肺中LIGHT 表達，引起小鼠支氣管周圍平滑肌增厚和上皮下纖維化的增加，產生以中性粒細胞增加為主的支氣管血管炎。但LIGHT 究竟如何促進肺組織重塑仍在探索中，目前已經證明，它可以誘導肺巨噬細胞和上皮細胞中的幾種炎癥分子，如轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β），胸腺基質淋巴細胞生成素（thymic stromal lym-phopoietin，TSLP）和MMP-9，間接地增強肺重塑反應［27-28］，CXCL1、3、5 等趨化因子是支氣管上皮細胞中LIGHT 的靶標，LIGHT 可能通過誘導各種趨化因子進一步擴增重塑表型，此外，LIGHT 還可以驅動肺成纖維細胞／肌成纖維細胞的增殖，這可能有助于增加平滑肌質量，因此，LIGHT 有可能以多種方式促進氣道重塑［29］。IL-1β 也可能誘導小鼠肺氣道重塑，若在每次HRV感染前24 h 給予小鼠IL-β 中和抗體，小鼠支氣管周圍平滑肌和上皮下纖維化顯著減少，支氣管肺泡灌洗液中的中性粒細胞亦明顯降低。另外，TGF-β 是由許多刺激驅動的肺氣道重塑的核心，主要與膠原蛋白的產生有關，有助于增加平滑肌質量，LIGHT 可以在肺巨噬細胞中上調TGF-β 表達，LIGHT、IL-1β 以及TGF-β 可產生協同作用，促進肺HRV 反復感染后氣道重塑［27］；②氣道上皮中EGFR 在環境屏障和氣道炎癥誘發方面起著核心作用，EGFR 的天然配體包括EGF、TGF-α、肝 素 結 合 表 皮 生 長 因 子（heparin-binding epidermal growth factor，HB-EGF）。雙調蛋白等，雙調蛋白來源于氣道平滑肌細胞，具有促進細胞生長和促炎作用，其分泌依賴于緩激肽（bradykinin，BK）誘導COX-2 表達、PGE2 分泌增加，即通過BK→COX-2／PGE2 自分泌環從氣道平滑肌細胞中表達并分泌。HRV 可增加哮喘肺中BK 釋放的激肽釋放酶活性，從而使雙調蛋白的分泌增加，促進氣道上皮下纖維化，HRV 也可誘導具有相似活性的生長因子（如成纖維細胞生長因子2 和HB-EGF）的基因表達增加［30-32］。

（4）促進氣道壁血管增生：氣道壁血管數量及大小增加是氣道重塑的重要特征，血管生成有賴于血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的生物效應，其通過與細胞表面上的酪氨酸激酶受體結合來刺激細胞應答。HRV 感染后早期即可顯著上調VEGF 的表達，主要通過p38絲裂原活化蛋白激酶和ERK 1／2 途徑［31］，介導氣道平滑肌細胞的促血管生成能力，并可能通過黏膜充血導致氣道狹窄來促進氣道重塑［33］。

（5）調節氣道平滑肌細胞遷移：Shariff 等［17］近期的研究顯示，HRV 感染氣道上皮細胞后可上調趨化因子的表達，如CCL5、CXCL8、CXCL10 等，并證實CCL5、CXCL8 可導致氣道平滑肌細胞向上皮細胞定向遷移，從而促進氣道重塑過程。其中CCL5 是最有效的趨化因子，而趨化因子CXCL10 的水平則與呼吸道分泌物中觀察到的淋巴細胞的數量增加相關［34］。細胞遷移通過激活受體而啟動，如G 蛋白偶聯受體（G-protein-coupled receptor， GPCR），酪 氨 酸 激 酶 受 體（receptor tyrosine kinase，RTK）和整聯蛋白（integrin）等，受體激活后其觸發下游細胞內信號傳導，導致氣道平滑肌細胞遷移［35］。

（6）誘導上皮-間質轉化（epithelial-stroma transformation，EMT）：EMT 是指上皮細胞通過特定程序轉化為具有間質表型特征的細胞生物學過程，細胞在EMT 過程中發生一系列改變，如失去細胞極性、喪失上皮標志、丟失細胞間的緊密連接和黏附連接、使細胞骨架重排以及失去間質標志表達等［36］。EMT 是目前研究哮喘氣道重塑機制的重點，E-鈣黏蛋白和波形蛋白分別代表上皮和間皮特征，E-鈣黏蛋白的表達降低，波形蛋白的表達增加以及從上皮細胞到間充質細胞（成纖維細胞／肌成纖維細胞）形態的轉變是EMT 過程的重要表現［37］。Fischer 等［38］在塵螨誘導小鼠哮喘發作的研究中，發現哮喘小鼠氣道上皮細胞E-鈣黏蛋白表達降低，波形蛋白表達增加，提示哮喘發病與EMT 相關。哮喘患者氣道上皮下區域中活化的間充質細胞數量增加，被認為是基質蛋白沉積導致網狀基底膜增厚的主要原因。Minor 等［39］在研究HRV 與哮喘EMT 關系的實驗中，也發現HRV 能夠誘導與EMT 一致的支氣管上皮細胞的表型和形態學變化。HRV 似乎在上皮標志物的喪失中發揮更大作用，且經TGFβ1 處理后，HRV 可明顯誘導上皮和間充質標志物的變化并改變其形態，誘導上皮細胞E-鈣黏蛋白表達顯著降低，間充質標記物纖連蛋白表達增加，間充質細胞數量增加，促進氣道重塑，此過程似乎涉及MAPK 途徑及轉錄阻遏物SLUG 的激活。

由此可見，HRV 感染在氣道重塑發生發展中發揮著重要作用，上皮細胞的HRV 感染引起上皮表型的改變，并觸發與氣道重塑的各個方面有關的基質蛋白和介質的釋放，在易感個體中，反復HRV 感染可導致上皮表型的永久改變，介導杯狀細胞增生和黏液分泌增加，上皮下纖維化，血管生成和平滑肌增加等，從而促進氣道重塑的進展［40］。

4.對臨床實踐的啟示：支氣管哮喘的防治給全球的衛生保健系統帶來了巨大的經濟負擔，HRV 感染在哮喘發生發展和急性發作、惡化中起著重要的作用，因此，找到有效限制HRV 對哮喘影響的藥物顯得十分重要，而目前包括皮質類固醇激素在內的減輕哮喘惡化的抗炎藥物，沒有證據表明這些藥物能直接治療HRV 誘導的炎癥，由于HRV 變異度很高，疫苗的開發亦很難實現，因此，抗病毒藥物治療是減少HRV 感染負擔所必需的［41］。就目前的研究來看，可從兩個方向出發：

（1）抑制HRV 感染和復制：①防止病毒與其受體結合，部分HRV-A 及HRV-B 通過與ICAM-1 受體黏附到細胞表面，吸入性重組可溶性ICAM-1 在實驗性治療中顯示可減少HRV 感染，使癥狀嚴重程度顯著降低，但研究中使用的可溶性ICAM-1 的成本和劑量方案不適用于廣泛的臨床治療［42］。衣殼結合藥物如pleconaril、pirodavir、vapendavir 等可結合病毒衣殼以限制其與細胞受體結合，Pleconaril 具有包括HRV在內的廣譜抗病毒活性，但因其副作用尚未獲得FDA 批準。Pirodavir 是HRV-A 和HRV-B 的有效體外抑制劑，但在天然HRV 感染的治療中未產生明顯臨床效益［43］；②開發蛋白酶抑制劑：HRV 的持續復制及后代病毒的組裝依賴于病毒蛋白酶3C（3Cpro）進行蛋白水解自我切割，現已開發不可逆HRV 3Cpro 抑制劑Rupintrivir 及新型腸道病毒蛋白酶抑制劑SG85。其被證實可有效限制HRV 的復制，現蛋白酶抑制劑正成功用于治療HIV 和丙型肝炎病毒感染，可進一步考慮新型HRV 3Cpro 抑制劑的開發［41］；③蛋白激酶D（PKD）抑制劑：HRV 感染可導致PKD 磷酸化，PKD 抑制劑可有效阻斷病毒蛋白和RNA 表達，從而阻斷HRV 復制，研究小分子靶向PKD 不失為抑制HRV 復制的一個選擇［44］。

（2）減少HRV 誘導的炎癥：①熱休克蛋白90（heat shock protein，Hsp90）抑制劑pochonin D：Hsp90 是一種分子伴侶，是許多病毒在其生命周期多個階段所需的關鍵宿主因子，包括病毒進入、核輸入、轉錄及復制。Pochonin D 是具有潛在Hsp90 抑制能力的根赤殼菌素類似物，具有作為廣譜抗病毒劑的潛力。一項用pochonin D 處理的HRV 感染小鼠的實驗表明，pochonin D 顯著降低小鼠肺裂解物和肺RNA 中促炎趨化因子／細胞因子（CCL2，CXCL1，TNF-α，IL-6 和IL1β）水平，減少中性粒細胞向炎癥部位的浸潤，并改善HRV 感染所致肺和氣道的病理損傷；②吉西他濱：吉西他濱作為腸道病毒71 的新型抑制劑，在體外也具有抗HRV 活性。一項評估吉西他濱對HRV 感染治療作用的小鼠模型實驗表明，鼻內給予吉西他濱可減少TNF-α 和IL-1β 等促炎細胞因子及肺浸潤淋巴細胞數量，顯著降低肺HRV 載量，其抗病毒活性可能與CTP 合成酶的抑制有關，也許可以把吉西他濱重新定位為抗病毒藥物，以抑制HRV 感染；③白藜蘆醇：白藜蘆醇（3，4′，5-三羥基-反式-二苯乙烯）是一種天然多酚，葡萄、花生、漿果中含量較多，具有抗氧化、抗炎、抗癌、心臟保護和神經保護等作用，通過抑制促炎介質的合成、抑制活化蛋白-1（activating protein-1，AP-1）和NF-κB 及調節絲裂原活化蛋白激酶／血紅素氧合酶下調炎癥反應，顯著降低TNF-α 和hs-CRP 水平。相關研究表明，白藜蘆醇可抑制HRV-16 誘導的ICAM-1 的表達，減少ICAM-1 糖基化以抑制HRV 進入細胞，并可以減弱氣道重塑相關的纖維化反應、上皮下膠原沉積和黏液分泌、肥大細胞脫顆粒反應，白藜蘆醇水性制劑與羧甲基β 葡聚糖（carboxymethyl beta glucan，CMG）組合的鼻噴霧劑可降低兒童呼吸道感染，緩解患兒鼻部癥狀和呼吸道感染后遺癥，白藜蘆醇的運用可能是理想的治療方法，對于治療HRV 感染和預防并發癥可能具有重要意義；④奧馬珠單抗：奧馬珠單抗是一種抗IgE 人源化單克隆抗體，與IgE 的Cε3區域特異性結合，劑量依賴性降低游離IgE 水平，抑制IgE 與效應細胞（肥大細胞、嗜堿粒細胞）表面的高親和力受體FcεR I 的結合，減少炎癥細胞的激活（如肥大細胞的脫顆粒）和多種炎性介質釋放。一項研究表明奧馬珠單抗可通過抑制IgE 介導的炎癥，減少HRV 感染期間病毒脫落的持續時間和峰值水平，并降低HRV 感染相關疾病的發生頻率和嚴重程度。奧馬珠單抗已于2017 年8 月24 日獲中國國家食品藥品監督管理總局（CFDA）批準上市。

綜上所述，HRV 感染在哮喘的發病、急性發作和加重中扮演重要角色，總結HRV 感染導致哮喘發生和惡化的機制，歸納HRV 感染所致的哮喘急性和加重的治療前沿和研究熱點，有助于深入了解HRV 的生物學特點及其致病機制。但是，仍需要進一步的研究，才能充分確定宿主對HRV 感染抗病毒免疫反應的關鍵方面，并探索出減輕HRV 感染對哮喘進展的方法，為未來哮喘精準治療提供更多靶點。如調節過敏性氣道炎癥以確保對疾病的最佳控制，阻斷關鍵炎癥途徑或增強抗病毒反應等，確定潛在的治療方法并在合適的模型中進行評估，評價安全性及有效性后充分應用于臨床，是控制HRV 感染相關哮喘的關鍵目標。