混菌固態發酵菜籽粕工藝優化

吳正可，劉國華，李陽，鄭愛娟，常文環，陳志敏，蔡輝益

混菌固態發酵菜籽粕工藝優化

吳正可，劉國華，李陽，鄭愛娟，常文環，陳志敏，蔡輝益

（中國農業科學院飼料研究所/生物飼料開發國家工程研究中心/農業農村部生物飼料重點實驗室，北京 100081）

【目的】通過優化菜籽粕混菌固態發酵工藝以提高菜籽粕營養價值，為發酵菜籽粕在我國畜牧養殖上的應用提供理論參考?！痉椒ā恳云胀ú俗哑蔀樵?，采用嗜酸乳桿菌、枯草芽孢桿菌、釀酒酵母3種菌株，以硫甙降解率（X%)、總酸增加率(Y%)、多肽增加率(Z%)為評價指標，并采用加權法以M為綜合評價指標（其中M = 0.7×X + 0.15×Y + 0.15×Z）評價發酵效果。其中，試驗一以3株菌的不同添加量為試驗因素，設計L9（34）三因素三水平正交試驗，探究各菌株添加量及不同的菌株組合方式對發酵效果的影響；在試驗一的基礎上配置混菌發酵液，以發酵溫度、料水比、發酵時間、接種量為試驗因素，設計L16（45）四因素四水平正交試驗，探究混菌固態發酵菜籽粕的最佳工藝，并結合最佳工藝進行中試驗證?！窘Y果】(1) 試驗一對以總變化率M為指標的正交試驗結果進行極差分析，結果顯示混菌固態發酵菜籽粕最佳混菌組合為嗜酸乳桿菌:釀酒酵母:枯草芽孢桿菌為=1﹕3﹕2，在該條件下，硫甙降解率為23.5%，總酸增加率為179.2%，多肽增加率為375.0%。(2) 在試驗一的基礎上設計試驗二并對結果進行極差分析，結果表明混菌固態發酵菜籽粕的最佳工藝條件為溫度：33℃、料水比：1﹕1、時間：84h、接種量：6%，在該工藝條件下進行中試驗證測得硫甙降解率為48.8%，總酸增加率為499.7%，多肽增加率為148.4%，總變化率為131.4%，符合試驗預期；對各單因素的方差分析結果顯示1水平溫度（31℃）總變化率顯著低于其他水平（< 0.05)，2水平溫度（33℃）總變化率高于3水平（35℃）和4水平（37℃），但差異不顯著（> 0.05)；2水平（1﹕1）的料水比總變化率高于其他水平，差異未達到顯著水平（>0.05)；3水平（84 h）的發酵時間總變化率高于其他水平，但差異未達到顯著水平（>0.05)；接種量各水平之間對總變化率的影響差異不顯著（> 0.05)。(3)在該最佳工藝條件下，微生物固態發酵增加了菜籽粕粗蛋白含量（從37.05％到40.90％)并降低了粗纖維濃度（從17.47%到16.72%）；發酵菜籽粕氨基酸組成分析表明發酵增加了菜籽粕中各種氨基酸的含量，尤其是Asp，Thr，Ser，Glu，Pro，Ala和Lys；發酵后菜籽粕硫甙含量從36.08 μmol·g-1降至18.48 μmol·g-1；發酵增加了菜籽粕中多肽含量（從0.84%到2.09%）和總酸含量（從1.01%到6.05%）；菜籽粕發酵前后粗脂肪含量相似（4.31%和4.39%）?！窘Y論】通過本發酵工藝對菜籽粕進行混菌固態發酵可有效降解菜籽粕中的硫甙，并提高菜籽粕中多肽和總酸的含量，菜籽粕營養價值得到有效改善。

菜籽粕；混菌；固態發酵；正交設計

0 引言

【研究意義】蛋白質是動物飼糧中的重要組成部分，一般由豆粕提供。近年來，隨著中國畜牧養殖業的快速發展及養殖體量的進一步擴大，常規飼料原料尤其是蛋白原料供應緊缺，限制著中國畜牧養殖業的健康發展。據統計，2018年中國豆粕使用量為7 230萬t，其中95%來自于美國、巴西等國家的進口。在當前蛋白飼料原料競爭日趨激烈的國際背景下，中國傳統玉米-豆粕型動物飼糧結構將會發生變化，新型蛋白飼料資源的開發迫在眉睫，引入菜籽粕等雜粕的多元化飼糧配方將會成為中國畜牧養殖業的新常態[1]?！厩叭搜芯窟M展】菜籽粕是油菜籽在榨油過程中產生的副產物，其粗蛋白質含量在35%—45%，但由于菜籽粕中含有硫甙、單寧、植酸等抗營養因子，且粗纖維含量較高（11%—14%），限制了其在動物飼糧中的飼用價值[2-3]。硫甙是菜籽粕中毒性最強的抗營養因子，能夠直接影響動物甲狀腺發育，降低動物生產性能，影響動物免疫力[4]。近年來，研究人員發現微生物固態發酵能有效的降低菜籽粕中抗營養因子的含量，在替代豆粕方面具有較高的開發價值[5]。ROZAN等使用少孢根霉菌固態發酵處理菜籽粕40h后可降解菜籽粕中47%的硫甙[6]；DRAZBO 等的研究表明用6-植酸酶固態發酵菜籽粕可顯著降低菜籽粕中硫甙含量并可在一定程度上提高火雞生長性能[7]?！颈狙芯壳腥朦c】目前關于發酵菜籽粕的研究雖有大量報道，但對發酵效果的研究主要集中在硫甙的降解，發酵條件不一，發酵效果差異較大，菜籽粕營養價值的開發還有較大的空間?；诒菊n題組在微生物發酵飼料的大量前期工作上，本試驗擬通過兩個正交設計試驗探究不同菌株添加量及各發酵參數對發酵效果的影響，兼顧發酵菜籽粕硫甙的降解及營養價值的改善，深度挖掘發酵菜籽粕的飼用價值?！緮M解決的關鍵問題】明確各因素對發酵菜籽粕效果的影響，得出混菌固態發酵菜籽粕最佳發酵工藝，為微生物發酵菜籽粕的過程控制及規模應用提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 試驗時間及地點

本試驗于2016年10月至2017年6月在中國農業科學院飼料研究所農業部生物飼料重點實驗室進行。

1.2 試驗材料

菌種：嗜酸乳桿菌由農業農村部生物飼料重點實驗室篩選并保藏，枯草芽孢桿菌與釀酒酵母由山東大學微生物技術國家重點實驗室惠贈。菜籽粕為普通菜籽粕，購自北京金盛祥科技發展有限公司，其營養成分為粗蛋白37.05%，粗纖維17.47%，粗脂肪4.31%，多肽0.84%，總酸1.01%，硫甙36.08 μmol·g-1。

培養基：MRS培養基，LB培養基，YPD培養基，購自北京奧博星生物技術有限責任公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌種發酵培養液的制備 將菌株平板劃線培養，于各菌株平板上挑取單菌落于10mL相應液體培養基中，一定條件下（其中，嗜酸乳桿菌37℃恒溫靜置培養；枯草芽孢桿菌37℃、200r/min恒溫振蕩培養；釀酒酵母30℃、200r/min恒溫振蕩培養）培養24h后，按1%的接種量接種于150mL液體培養基中，培養21h后制成各單菌發酵培養液。

1.3.2 發酵步驟 取50g菜籽粕裝入250mL的錐形瓶中，將菌種和無菌水以一定的比例接入到發酵底物中，攪拌均勻，在試驗條件下恒溫靜置發酵，每隔12h翻料一次，發酵結束后45℃低溫烘干，粉碎過40目篩待測。

1.4 發酵條件優化

以發酵后菜籽粕中硫甙降解率（X%)、總酸增加率（Y%）、多肽增加率（Z%）為評價指標，采用加權法以M為綜合評價指標（其中M=0.7*X+0.15*Y+ 0.15*Z）探究3種菌株的添加量及不同組合比例對發酵菜籽粕的影響[8]，各菌株設置3個水平并設計L9(34) 三因素三水平正交試驗（表1）。

表1 L9（34）正交試驗設計

在確定混菌組合比例的基礎上進一步優化菜籽粕發酵工藝條件，以M為綜合評價指標（其中M=0.7×X+0.15×Y+0.15×Z），以發酵溫度、料水比、時間、接種量為試驗因素，設計L16（45）四因素四水平正交試驗（表2）。

表2 L16（45）正交試驗設計

1.5 最優條件中試發酵發菜籽粕

參照前期優化條件，按1.3所述方法，采用安裝有單向呼吸閥的發酵袋恒溫靜置中試發酵菜籽粕40kg，每隔12h翻料一次，發酵袋為普通發酵袋，購自北京百旺通達科技有限公司。發酵結束后45℃低溫烘干，粉碎過40目篩，測定發酵后菜籽粕中硫甙、總酸、多肽、蛋白質及氨基酸含量。

1.6 測定指標及方法

參照文獻[9]，采用氯化鈀比色法測定菜籽粕發酵前后硫甙的含量；采用杜馬斯全自動定氮儀測定樣品粗蛋白含量；參照GB/T 22492-2008 大豆肽粉的測定方法測定多肽含量[10]；參照文獻[11]采用滴定法測定發酵前后總酸含量（結果以乳酸計）；采用氨基酸自動分析儀測定發酵前后菜籽粕氨基酸含量變化。每個指標測3個重復。

1.7 數據統計與分析

正交試驗數據通過軟件SPSS19.0中的一般線性模型分析，結合Duncan法進行多重比較，結果以平均值表示，以＜0.05作為差異顯著性判斷標準。

2 結果

2.1 不同混菌比例對總變化率的影響

對以總變化率M為指標的正交試驗進行極差分析（表3），結果顯示當3株菌組合比例為嗜酸乳桿菌﹕釀酒酵母﹕枯草芽孢桿菌=1﹕3﹕2時，總變化率M最大?？莶菅挎邨U菌對總變化率的影響最大，釀酒酵母次之，嗜酸乳桿菌的影響最小。正交試驗中包含該最佳組合，且總變化率為99.55%，明顯高于其他處理，由此將后期混菌組合設為嗜酸乳桿菌﹕釀酒酵母﹕枯草芽孢桿菌=1﹕3﹕2。

表3 混菌接種量L9（34）正交試驗

2.2 混菌固態發酵菜籽粕工藝優化

混菌固態發酵菜籽粕工藝優化L16（45）正交試驗結果見表4。通過極差分析可知，最佳發酵工藝條件為溫度：33℃、料水比：1﹕1、時間：84h、接種量：6%，在該工藝下，總變化率理論上最高。溫度對總變化率的影響最大，時間和料水比次之，接種量對總變化率的影響最小。

2.2.1 不同因素和水平對總變化率M的影響 由表5可知，1水平溫度（31℃）總變化率顯著低于其他水平（< 0.05），2水平溫度（33℃）總變化率要高于3水平（35℃）和4水平溫度（37℃），但無顯著差異（> 0.05）。2水平的料水比（1﹕1）總變化率高于其他水平（> 0.05）。3水平發酵時間（84h）總變化率高于其它水平，差異不顯著（> 0.05）。接種量各水平對總變化率的影響差異不顯著（> 0.05）。

2.2.2 不同因素和水平對硫甙降解率的影響 由表6可知，1水平溫度下（31℃）硫甙降解率顯著低于其他水平（< 0.05），2水平溫度下（31℃）硫甙降解率最高?？傋兓孰S料水比水平的提高而增加，但無顯著差異（> 0.05)。隨時間的延長，硫甙降解率呈升高的趨勢，4水平時間（96h）的硫甙降解率高于其他水平，但差異不顯著（> 0.05)。接種量各水平對硫甙降解率無顯著影響（> 0.05)。

表4 混菌發酵多因素試驗結果

表5 不同因素和水平對總變化率M的影響

同列數據標不同小寫字母表示差異顯著（<0.05）。下同

Valves in the same row with different small letter mean significant difference (<0.05). the same as below

表6 不同因素和水平對硫甙降解率的影響

2.2.3 不同因素和水平對總酸和多肽增加率的影響 不同因素和水平對總酸和多肽增加率的影響方差分析見表7和表8。由表可知，溫度對總酸增加率的變化呈先升高后降低的趨勢，在2水平溫度（33℃）時達到最大值，顯著高于1水平溫度（31℃）（<0.05)。料水比對總酸增加率的影響亦先升高后降低。當發酵時間為3水平時（84h）總酸增加率達到最大。接種量和料水比對總酸增加率的影響差異不顯著（> 0.05)。1水平的料水比（1:0.8）多肽增加率最高，發酵時間和接種量對多肽增加率無顯著影響（> 0.05)。

表7 不同因素和水平對總酸增加率的影響

表8 不同因素和水平對多肽增加率的影響

2.3 中試驗證試驗

參照混菌發酵多因素結果，設定試驗因素為溫度：33℃、料水比：1﹕1、時間：84h、接種量：6%，中試發酵40kg菜籽粕，發酵結束后測得硫甙降解率為48.79%，總酸增加率為499.65%，多肽增加率為148.37%，總變化率為131.36%，接近于試驗組中最高的總變化率134.04%。

2.4 最佳發酵條件下菜籽粕氨基酸及其他營養成分含量變化

中試發酵后氨基酸含量變化見表9。由表可知發酵菜籽粕粗蛋白較發酵前提高了5.26%，絲氨酸、蘇氨酸、谷氨酸、脯氨酸、丙氨酸、纈氨酸、賴氨酸均有較大程度的提高。

3 討論

3.1 各菌株添加量及不同組合比例對發酵菜籽粕效果的影響

本試驗采用三因素三水平正交試驗探究各菌株添加量及比例對發酵菜籽粕效果的影響。本試驗所用的嗜酸乳桿菌、枯草芽孢桿菌和釀酒酵母均列入我國農業農村部《飼料添加劑品種目錄》[12]，符合農業農村部關于飼料微生物添加劑的相關規定。嗜酸乳桿菌對總變化率的影響顯著（< 0.05），且隨著嗜酸乳桿菌接種量的增高，總變化率呈降低的趨勢，這可能是因為過多的乳酸菌在發酵前期產生大量的有機酸降低了基質pH，在一定程度上抑制了枯草芽孢桿菌和釀酒酵母的生長[13-14]。嗜酸乳桿菌與枯草芽孢桿菌及釀酒酵母在發酵過程中存在協同及共生作用[15]。發酵前期，枯草芽孢桿菌和釀酒酵母利用發酵體系中的蛋白及碳水化合物的能力較強，能夠快速分解蛋白質形成更易被動物和微生物利用的多肽和氨基酸，促進了嗜酸乳桿菌的增殖，同時進一步降低發酵基質pH，有效的抑制雜菌的污染[16]。隨著發酵體系內氧氣的消耗及pH的降低，枯草芽孢桿菌的生長受到抑制，釀酒酵母也從有氧發酵進入厭氧發酵。孫林等的研究顯示嗜酸乳桿菌和蠟樣芽胞桿菌對發酵菜籽粕的交互作用達到顯著水平[17]。蔣玉琴等使用不同比例的乳酸菌、酵母菌、少孢根霉發酵菜籽粕效果要優于單菌發酵[18]。

表9 發酵菜籽粕氨基酸及其他營養成分變化（風干基礎）

3.2 不同因素及水平對發酵菜籽粕效果的影響

溫度是影響發酵效率的重要因素。每種微生物都有其最適生長溫度，多菌株形成的微生物區系亦有其最適溫度范圍，超過或低于其最適溫度均不利于微生物的生長[19]。其次，溫度能直接影響微生物源蛋白酶及纖維素酶活性，從而間接影響發酵效果。微生物發酵是一個代謝產熱的過程，溫度過高會導致發酵飼料內部產熱過快造成熱量聚集，不利于微生物的生長[20]。高冬余等的研究表明，溫度對發酵菜籽粕效果的影響達到極顯著的水平，且在一定范圍內發酵效果隨溫度的升高而降低[21]。發酵時間是影響發酵菜籽粕效果的另一個重要因素[22]。選擇合適的發酵時間，不但能有效的提高發酵效率，還能減少發酵過度而產生不必要的浪費。本研究發現，隨時間的增加，總變化率呈先增高后降低的趨勢，這說明微生物發酵菜籽粕并非是時間越久越好。隨著時間的延長，發酵基質內大量的微生物會優先利用被分解的小分子蛋白合成自身微生物菌體蛋白，發酵基質內的多肽含量也是先增高后降低?？偹岷侩S時間變化不大，這主要是不同微生物相互作用維持內環境穩態的結果[3]。料水比是影響微生物活性的重要因素，水分過高會導致基質黏性增加并減少基質內氣體交換，但能促進基質內營養成分和菌體的流動性[23]；而基質水分過低會影響乳酸菌的活性，菌體生長受到抑制，酶的產量減少[24]。本試驗最佳料水比為1﹕1，這一研究結果與肖萌等的報道類似[19]。本研究還發現，接種量對總變化率及其他指標的影響不顯著，這可能是隨著時間的延長，各接種量最終都會達到一個基質容量內的最大微生物量[25]。

3.3 發酵對菜籽粕氨基酸含量的影響

動物對蛋白質和氨基酸的利用率是評價蛋白原料質量的重要標準。原料中蛋白分子量越小，多肽含量越高，氨基酸組成越平衡，越容易被動物消化吸收[26]。本試驗發現微生物發酵處理不僅提高了菜籽粕中多肽的含量，粗蛋白及各氨基酸含量也均有不同水平的提高，其主要原因是隨著發酵的進行，微生物消耗碳水化合物產生的“濃縮效應”，導致粗蛋白和氨基酸含量提高。同時大部分必需氨基酸含量提高的比例要高于粗蛋白提高的比例，其原因可能是微生物分泌的轉氨酶利用轉氨基作用將非必需氨基酸合成為動物的必需氨基酸，同時微生物還能利用飼料中的各種非蛋白氮合成蛋白氮，提高各種氨基酸的比例。精氨酸是動物體內生物學功能最多的一種氨基酸，在體內物質代謝、免疫調節等方面有重要作用，同時精氨酸含量升高還有促進動物對其他氨基酸吸收利用的作用[27]。酪氨酸可在體內酪氨酸羧化酶的作用下轉變為多巴胺、腎上腺素、去甲腎上腺素等物質，對體內內環境穩定及神經-體液調節系統有重要的作用[28]。賴氨酸是畜禽日糧中的第一限制性氨基酸，賴氨酸含量的提高有助于促進日糧氨基酸平衡并提高蛋白利用效率[29]。低蛋白日糧和氨基酸平衡是近年來動物營養學研究的熱點之一，促進原料氨基酸平衡可以準確預測原料營養價值，減少不必要的氮排放對環境污染帶來的影響[30]。本研究結果表明，發酵菜籽粕可以提高菜籽粕多肽和各種氨基酸的含量，有助于促進原料氨基酸平衡，為低蛋白日糧和氨基酸平衡的研究提供一種新的理論和方法。

4 結論

混菌固態發酵菜籽粕最佳發酵工藝為發酵溫度33℃，料水比1﹕1，發酵時間84h，接種量6%，其中混菌組合方式為嗜酸乳桿菌﹕枯草芽孢桿菌﹕釀酒酵母=1﹕3﹕2。在該工藝條件下，發酵菜籽粕硫甙降解率為48.79%，總酸增加率為499.65%，多肽增加率為148.37%，總變化率為131.36%。通過對菜籽粕發酵工藝優化，降低了菜籽粕中硫甙的含量并改善菜籽粕營養價值，提高了菜籽粕中多肽和總酸的含量，具備一定的益生價值。該發酵工藝時間短，效率高，操作簡單，易于推廣，發酵后可以直接添加在家禽和家畜飼料中，但發酵菜籽粕對家禽和家畜生產性能的影響及最適用量還需進一步的研究。

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Optimization of Solid State Fermentation for Rapeseed Meal with Mixed Strains

WU ZhengKe, LIU GuoHua, LI Yang, ZHENG AiJuan, CHANG WenHuan, CHEN ZhiMin, CAI HuiYi

(Feed Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences/National Engineering Research Center of Biological Feed/Key Laboratory of Feed Biotechnology of Agricultural Ministry, Beijing 100081)

【Objective】The aim of this study was to optimize the solid state fermentation conditions for rapeseed meal with mixed strains and to improve the feeding value of rapeseed meal. It would provide a reference for the application of fermented rapeseed meal in animal husbandry in China.【Method】The rapeseed meal used in this study was conventional rapeseed meal. Three strains of,andwere used, and the glucosinolates degradation rate (X%), total acid increase rate (Y%), polypeptide increase rate (Z%) were used as evaluation indexes. Method M was used as the comprehensive evaluation index (M=0.7*X+0.15*Y+0.15*Z). In the experiment one, the effects of different strains addition levels and the best mixed ratio of the three strains in fermented rapeseed meal were investigated through L9(34) three-factors and three-levels orthogonal array design methods. Based on the result of experiment one, an L16(45) four-factors and four-levels of orthogonal array design experiment was designed to explore the optimal conditions of mixed strains solid state fermentation of rapeseed meal, and the fermentation temperature, feed water ratio, time, and inoculation quantity were selected as experimental factors. 【Result】The results showed as follow: (1) L9(34) orthogonal array design showed that the optimal mixed strains ratio of fermented rapeseed meal were::= 1:3:2. Under these condition, the contents of glucosinolates was degraded by 23.5%, the total acid and polypeptide increase rate were 179.2% and 375.0%, respectively. (2) Based on the result of experiment one, the range analysis of experiment two showed that the optimal conditions of mixed strains solid state fermentation of rapeseed meal were as follows: fermentation temperature was 33 °C, feed water ratio was 1:1, time was 84h and inoculation quantity was 6%. The pilot test of this conditions showed that the contents of glucosinolates was degraded by 48.8%, the total acid increase rate was 499.7%, the polypeptide increase rate was 148.4%, and the total change rate M was 131.4%. The results were in line with our expectation. The lowest total change rate M was noted when the temperature was 31 °C, and the total change rate M in temperature 33 °C was higher than 35 °C and 37 °C, but the difference between groups was not significant (> 0.05). The higher M was also noted when feed water ratio was 1:1.0 and fermentation time was 84h. No significant differences in M were observed between conditions in different levels of inoculation quantity. (3) The fermentation of rapeseed meal by mixed strains also increased the content of CP (37.05% vs. 40.90%) and decreased the concentration of crude fiber (17.47% vs. 16.72%). The amino acid composition of rapeseed meal and fermented rapeseed meal showed that fermentation increased the content of several amino acids in rapeseed meal, especially Asp, Thr, Ser, Glu, Pro, Ala, and Lys. The greatest change caused by fermentation was for glucosinolates, which decreased from 36.08 μmol·g-1to 18.48 μmol·g-1. The fermentation of rapeseed meal increased the content of polypeptides (from 0.84% to 2.09%) and increased the content of total acid (from 1.01% to 6.05%) compared to unfermented rapeseed meal. The concentration of crude fat was similar in rapeseed meal and FRSM (4.31% and 4.39%).【Conclusion】The optimal fermentation conditions could effectively degrade the glucosinolates and increase the content of polypeptide and total acid in rapeseed meal, so the nutritional value of rapeseed meal was significantly improved.

rapeseed meal; mixed strains; solid state fermentation; orthogonal design

2018-08-02；

2019-09-20

現代農業產業技術體系國家肉雞產業技術體系項目（CARS-42）

吳正可，E-mail：wzk199107@163.com。通信作者劉國華，E-mail：liuguohua@caas.cn

（責任編輯 林鑒非）