液相色譜-串聯質譜法同時測定飼用血液制品中18種β-受體激動劑

索德成，魏書林，肖志明，王培龍，王瑞國，李陽

液相色譜-串聯質譜法同時測定飼用血液制品中18種β-受體激動劑

索德成，魏書林，肖志明，王培龍，王瑞國，李陽

（中國農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所，北京 100081）

【背景】飼用血液制品是一種非常規動物源性飼料原料，由家畜或家禽的血液凝成塊后經高溫蒸煮，壓除汁液、晾曬、烘干后粉碎而成，主要用于畜牧養殖。但由于動物養殖過程中存在非法使用β-受體激動劑的現象，一些含有β-受體激動劑的血液制成飼用血液制品可能成為對人類健康潛在的危害源頭。為了降低安全風險，研究飼用血液制品中β-受體激動劑的方法是十分必要的。β-受體激動劑檢測方法主要有酶聯免疫吸附分析（ELISA）法、高效液相色譜（HPLC）法、氣質聯用（GC-MS）法和液相色譜串聯質譜（LC-MS/MS）法等。目前所有方法或標準大多針對商業成品飼料或動物源性食品，缺乏對飼用血液制品中β-受體激動劑的檢測技術進行相關的研究?！灸康摹繛榱搜芯亢捅O控飼用血液制品中β-受體激動劑的情況，研究建立了固相萃取結合液相色譜-串聯質譜檢測飼用血液制品中18種β-受體激動劑的方法?！痉椒ā糠Q取2 g（精確至0.01 g）血液制品樣品于50 mL離心管中，準確加入20 mL乙酸銨提取液（pH=5.2）和50 μLβ-葡萄糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶，漩渦混合均勻，于37 ℃水解過夜（應大于16h），然后8 000 r/min離心5 min，取5 mL上清液轉移至另一離心管中，加入0.5mL 高氯酸溶液，漩渦混合30 s, 然后于8 000r/min離心5min，上清液備用。PCX固相萃取小柱依次用3 mL甲醇，3 mL水活化。取上清液過柱，用3 mL水和3 mL甲醇淋洗，抽干，用3 mL氨水甲醇溶液洗脫，洗脫液于50 ℃氮氣吹至近干，用1.0 mL 0.1%甲酸水+乙腈溶液（95+5）溶解，過0.22 μm濾膜。進Waters TQ液相色譜串聯質譜儀檢測，使用ACQUITY UPLC BEH C18(100 mm,2.1 mm，1.7μm) 色譜柱。乙腈和0.1％甲酸溶液做流動相，梯度洗脫。質譜電離方式采用電子噴霧離子源，正離子檢測方式，多反應監測（HRM）。噴霧電壓為3.5 kV；霧化氣溫度為480℃；源溫度為150℃；霧化氣流速為600L·h-1；錐孔氣流速為5 L·h-1。脫溶劑氣、錐孔氣、碰撞氣均為高純氮氣?！窘Y果】18種β-受體激動劑在5—100μg·L-1呈良好的線性關系，相關系數在0.99—0.999之間。在血粉、血漿蛋白粉、血球蛋白粉三種基質中在5、10 和50 μg·kg-1三個添加水平上的平均回收率為65.1%—110%之間，相對標準偏差小于15%，批間變異系數小于20%。檢出限為低于5ng·g-1?！窘Y論】從方法回收率、精密度結果及實際樣品的檢測結果來看，該方法適用于血液制品中β-受體激動劑的監測。

β-受體激動劑；液相色譜-串聯質譜；飼用血液制品

0 引言

【研究意義】β-受體激動劑（β-agonists）俗稱“瘦肉精”，是苯乙胺類藥物。在醫學主要用于擴張支氣管和增加肺通氣量，治療支氣管哮喘。β-受體激動劑能顯著提高動物酮體瘦肉率、增重和提高飼料轉化率。因此，β-受體激動劑被非法使用于畜牧生產，以促進家畜生長和改善肉質[1-4]。導致了動物性食品中藥物殘留嚴重超標，消費者食用這類食品后會產生嚴重的毒副作用，至今已發生了多起“瘦肉精”集體中毒事件[5-8]。為此，中國和歐盟禁止β-受體激動劑在動物養殖中使用[8-11]。飼用血液制品是一種非常規動物源性飼料原料，由家畜或家禽的血液凝成塊后經高溫蒸煮，壓除汁液、晾曬、烘干后粉碎而成，其主要類型有血粉、血漿蛋白粉、血球蛋白粉等[12]。其在畜禽及水產養殖過程中大量應用[13-15]。由于血液制品的加工原料來源自于動物血液，如果在生產過程中使用了含有β-受體激動劑的動物血液，常規加工無法將殘留于血液中的β-受體激動劑去除，會使β-受體激動劑在飼用血液制品中殘留，進而影響飼料質量和畜產品安全。因此，為了評價飼用血液制品中含有β-受體激動劑風險，建立飼用血液制品中β-受體激動劑的檢測方法是十分必要的?！厩叭搜芯窟M展】目前國際上β-受體激動劑檢測方法主要有酶聯免疫吸附分析（ELISA）法、高效液相色譜（HPLC）法、氣質聯用（GC/MS）法和液相色譜串聯質譜（LC-MS/MS）法[16-28]，BUCKNALL 等建立了競爭ELISA 檢測法用于檢測牛肝中的克倫特羅殘留，檢測限達到0.5 ng·g-1[16]。KOOLE 等應用免疫親和凈化，建立了高效液相色譜檢測尿液中5種β-受體激動劑的方法，檢測限達到ng·mL-1水平[20]。LIU等研究建立GC-MS檢測牛組織中β-受體激動劑的方法，應用N-甲基-N-（三甲基硅烷）三氟乙酰胺進行衍生, 檢測限達到5 ng·g-1 [22]。ELISA為目前主流的篩選方法。但是無法對樣品中β-激動劑含量進行定量確證；液相色譜法對樣品基質要求較高，檢測限較高，無法滿足監測要求；氣相色譜串聯質譜聯用儀測定β-激動劑需要衍生，樣品重復性差。近年應用LC-MS/MS進行β-激動劑多殘留檢測的研究日趨增多[25-28]?！颈狙芯壳腥朦c】現有方法或標準大多針對商業成品飼料或動物源性食品，目前尚無飼用血液制品中β-受體激動劑的檢測技術，這在一定程度上加大了飼料企業使用血液制品的風險，也限制了政府部門對β-受體激動劑的有效監管，因此，亟需飼用血液制品中β-受體激動劑的檢測方法?！緮M解決的關鍵問題】針對血液制品成分復雜、蛋白質和脂肪含量高的問題，通過摸索液相質譜條件的優化、提取、凈化方法，建立了一種準確、靈敏測定飼用血液制品中18種β-受體激動劑含量的LC-MS/ MS方法。為飼用血液制品的風險評價和政府監管提供必要的技術支撐。

1 材料與方法

試驗于2014年6—10月在中國農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所實驗室完成。

1.1 儀器與試劑

Acquity 超高效液相色譜帶有TQ三重四極桿質譜儀（美國Waters 公司）；PCX混合型陽離子交換柱（美國Agilent公司）。MS2 漩渦混合器（德國IKA 公司）；Centrifuge 5810 離心機（德國Eppendorf 公司）；固相萃取裝置（美國Supelco 公司）。

除非另有說明，所用試劑均為分析純，購自于北京化學試劑公司。流動相所用試劑甲酸，乙腈、甲醇均為色譜純（Fisher ChenAlert Guide 公司）；實驗用水為Mili-Q純化后的超純水（＞18 MΩ）?？藖鎏亓_、沙丁胺醇、萊克多巴胺、齊帕特羅、氯丙那林、特布他林、西馬特羅、西布特羅、馬布特羅、溴布特羅、班布特羅、克侖普羅、妥布特羅、利托君、沙美特羅、克倫塞羅、福莫特羅和苯乙醇胺A對照品分別購自于德國Dr. Ehrenstorfer 公司、美國Sigma公司等：純度≥97%。飼用血液制品（血粉、血漿蛋白粉、血球蛋白粉）樣品從配合飼料生產工廠的原料庫采集，其來源于中國、美國、新西蘭等地。陽性血液制品樣品的血液來源于公益性行業（農業）科研專項項目（No. 201203088）的動物試驗[30]，參照血液制品的生產工藝制備成血粉，并塑封保存于0—4℃的冰箱中。

1.2 溶液配制

β-受體激動劑貯備液：分別精密稱取各種β-受體激動劑對照品至棕色容量瓶中，用甲醇配成濃度約為1mg·mL-1的標準貯備液，2℃—8℃冷藏保存，有效期十二個月。

β-受體激動劑標準工作液：分別精密吸取各種β-受體激動劑貯備液，用初始流動相稀釋成濃度為1μg·mL-1的標準工作液。2℃—8℃冷藏保存，有效期一個月。

1.3 樣品處理

稱取2 g（精確至0.01 g）樣品于50 mL離心管中，準確加入20 mL乙酸銨提取液（pH=5.2）和50 μLβ-葡萄糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶，漩渦混合均勻，于37 ℃水解過夜（應大于16 h），然后8 000 r/min離心5 min，取5 mL上清液轉移至另一離心管中，加入0.5 mL 高氯酸溶液，漩渦混合30 s, 然后于8 000r/min離心5 min，上清液備用。

PCX固相萃取小柱依次用3 mL甲醇，3 mL水活化。取上清液過柱，用3 mL水和3 mL甲醇淋洗，抽干，用氨水甲醇溶液3 mL洗脫，洗脫液于50 ℃氮氣吹至近干，用1.0 mL初始流動相溶解，過0.22 μm濾膜。供液相色譜-串聯質譜測定。

同時選取待測樣品類型相同的空白血液制品（血粉、血球蛋白粉、血漿蛋白粉）樣品，按上述步驟處理，在凈化、吹干后的殘渣中，分別添加適量的混合標準工作溶液，配置成不同濃度（1—100μg·L-1）的基質添加標準曲線，進行基質加標定量。

1.4 色譜質譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm, 2.1 mm，1.7μm）柱溫：30℃；進樣量：10 μL。流動相及參考梯度洗脫程序見表1。

表1 流動相及參考梯度洗脫程序

質譜采用電子噴霧離子源，正離子檢測方式，多反應監測（HRM）。噴霧電壓為3.5 kV；霧化氣溫度為480℃；源溫度為150℃；霧化氣流速為600L·h-1；錐孔氣流速為5 L·h-1。脫溶劑氣、錐孔氣、碰撞氣均為高純氮氣，使用前應調節各氣體流量以使質譜靈敏度達到檢測要求。定性離子對、定量離子對及對應的錐孔電壓和碰撞能量見表2。

表2 β-受體激動劑的定性、定量離子對及錐孔電壓、碰撞電壓的參考值

2 結果

2.1 不同提取方式對血粉樣品提取效率研究

本研究比較了4種方法對血粉陽性樣品的檢測：1.酶解（EME）：取1g陽性樣品，加入5mL的乙酸銨緩沖液（pH 6. 8），并加入50 μLβ-鹽酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶，于37℃溫育過夜。2. 有機溶劑加酸提?。∕SE）:取1g陽性樣品，加入5mL0.1mol·L-1鹽酸溶液+甲醇溶液提取。3. 高氯酸水解（ACE）：取1g陽性樣品，加5mL0.2 mol·L-1高氯酸溶液，搖勻,于60℃水解4h。4.堿水解（ALE）:取1g陽性樣品，加入5mL 0.1mol·L-1氫氧化鈉溶液，搖勻，于60℃水解4h。

結果見圖1，不同處理方法對各種血液制品的不同激動劑檢測結果有所差距。對于血液制品來說，有機溶劑提取克倫特羅和苯乙醇胺A效果較好，但是對萊克多巴胺和沙丁胺醇的提取效果很差；高氯酸水解和堿水解能提取出大部分原型藥物，但是提取效率相比酶解較低，酶解對4種常見激動劑提取效果最好，同時酶解后測得的萊克多巴胺和沙丁胺醇的含量要明顯高于其他提取方法。

2.2 線性與檢出限（LOD）、定量限（LOQ）

以每種β-受體激動劑標準溶液濃度為橫坐標，β-受體激動劑的色譜峰面積比為縱坐標繪制標準曲線，試驗表明18種β-受體激動劑在5—100μg·L-1呈良好的線性關系，相關系數在0.99—0.999之間。在本試驗條件下，根據3倍噪音的峰響應值，確定檢出限。根據回收率和精密度結果確定定量限。線性、檢出限和定量限的結果見表3。

圖1 不同提取方法對實際血液制品中4種受體激動劑的結果

表3 β-受體激動劑標準溶液線性、LOQ，㎏LOD

2.3 回收率與精密度

我們選取3種飼用血液制品樣品作為測試對象，進行加標回收率試驗，以考察方法的準確度和現性。配制5、10和50μg·kg-1等3個濃度的試樣，每批次內同一濃度做6次平行試驗。批間重復3次。結果見表4。由表看出，方法回收率達到65.6 %—110 %之間，相對標準偏差均<15%，批間變異系數小于20%。說明該方法對不同樣品中β-受體激動劑的測定均有較好的回收率和準確度。

表4 飼用血液制品回收率與精密度實驗結果(n＝6)

續表4 Continued table 4

3 討論

3.1 流動相的選擇

基于β-受體激動劑類藥物都具有較強的水溶性，首先選擇以甲醇和水作為基本流動相條件，但在質譜分析時發現有些組分的檢測靈敏度較差。為了提高電離效率，優化靈敏度參數，筆者使用0.1%甲酸水溶液和乙腈代替純水和甲醇體系。同時在流動相條件中設置梯度條件可有效分離β-受體激動劑。避免樣品中的基質干擾，使得定性和定量更加準確。

3.2 監測離子對的選擇

采用100 ng·L-1β-受體激動劑化合物的標準溶液分別以流動注射的方式在正離子模式下進行母離子全掃描，確定標準物的分子離子,然后分別以其分子離子為母離子，進行二級離子全掃描，選取豐度較強、干擾較小的子離子為定性及定量離子，具體參數見表2。典型的分離色譜圖見圖2。

1：齊帕特羅、2：沙丁胺醇、3：特布他林、4：西馬特羅、5：西布特羅、6：利托君、7：克侖塞羅、8：萊克多巴胺、9：克侖普羅、10：氯丙那林、11：福莫特羅、12：妥布特羅、13：克侖特羅、14：溴布特羅、15：班布特羅、16: 馬布特羅、17：苯乙醇胺A、18：沙美特羅

3.3 樣品前處理方法的確定

3.3.1 提取液及提取方式的選擇 β-受體激動劑經過在動物體內吸收、代謝的一系列生化反應，大部分β-受體激動劑能生成葡萄糖苷酸或硫酸等軛合代謝物[1]，因此，血液制品中β-受體激動劑的殘留主要以軛合物存在，因此在測定血液制品中β-受體激動劑前，首先要將軛合型β-受體激動劑解離。李陽等研究了酶解及有機溶劑提取對綿羊血漿中萊克多巴胺和沙丁胺醇含量測定的影響，結果表明，綿羊血漿中萊克多巴胺軛合率大于95%，沙丁胺醇軛合率約為40%，使用β葡萄糖醛苷/芳基硫酸酯酶可有效解離血漿中軛合的萊克多巴胺和沙丁胺醇[25]。強致懿等在65 ℃條件下用20μL葡萄糖苷酶酶解萊克多巴胺，發現酶解之后血液中萊克多巴胺含量要比酶解前高出1.5—2.5倍[29]。雖然目前還沒有關于其他受體激動劑在動物血液內的存在形式的報道，但是結合β-受體激動劑在其他組織的代謝規律和對陽性血粉樣品結果（圖 1）可以認為：酶解能有效地將軛合態β-受體激動劑解離，而且酶解的特異性較高，酶形成的雜質較少，更有利于目標物的濃縮和凈化[26-27]。因此，本試驗選擇用β葡萄糖醛苷/芳基硫酸酯酶來酶解樣品中β-受體激動劑軛合代謝物。

由于血粉樣品含有大量水溶性血紅蛋白，經過酶解后樣品提取液殘存大量的蛋白質，對下一步SPE凈化有很大的影響，需采取手段沉淀蛋白。我們比較了乙酸鉛溶液和高氯酸溶液沉淀蛋白質效果，表明高氯酸溶液效果較好，凈化效果見圖3。同時比較加入0.5 mL 5%、10%、30%、50%的高氯酸溶液對沉淀蛋白質效果和回收率的影響，綜合考慮，0.5 mL 30%高氯酸溶液效果最好。

圖3 高氯酸溶液處理前后對比圖

3.3.2 凈化 目前常用的β-受體激動劑樣品凈化主要有兩種方式，液液萃取和固相萃取。本試驗選取了液液萃取，弱陽離子交換柱、C18柱，混合型陽離子交換柱進行比較。結果表明混合型陽離子交換柱凈化效果較好，并且對實際樣品的回收率較好，綜合回收率和對空白樣品和添加樣品的凈化效果，最終選取混合型陽離子交換柱對樣品進行分離富集。同時，本研究中比較各種商品化了的混合型陽離子交換柱（包括Agilent Bond Elut Plexa PCX，Agela PCX 2, Oasis MCX柱）的凈化效果，結果表明都對β-受體激動劑凈化有非常好的效果。

3.4 基質效應

基質效應是LC-MS/MS 檢測的最常見的問題。不同血液制品樣品的組成比較復雜，其中含有大量的的蛋白質、脂肪和鹽等干擾物，會對檢測方法的靈敏度和準確性造成一定的影響，進而影響試驗的檢測結果。不同的基質效應對檢測方法的靈敏度造成的影響也不同，為了降低基質效應對定量準確度的影響。本研究采用基質添加標準曲線來定量以彌補離子抑制造成的損失。

3.5 實際樣品檢測

應用建立的方法，對50份隨機收集飼用血液制品樣品進行測定，5份樣品檢出β-受體激動劑類藥物殘留，其他未檢出β-受體激動劑類藥物殘留。陽性樣品中1份檢出西馬特羅、含量為234 ng·g-1。4份檢出萊克多巴胺，含量為 35—432ng·g-1之間。萊克多巴胺的檢出血粉主要集中于美國進口的產品中，可能與美國允許使用萊克多巴胺作為飼料添加劑有關。

4 結論

本研究建立了基于酶解法對飼用血液制品中β-受體激動劑殘留的提取，采用PCX固相萃取柱濃縮凈化，UPLC-MS/MS法同時檢測飼用血液制品中18種β-受體激動劑，方法回收率和精密度符合痕量分析的要求，操作簡便、分析效率高，可用于相關樣品的日常檢測及殘留監控。

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SUO DeCheng, WEI ShuLin, XIAO ZhiMing, WANG PeiLong, WANG RuiGuo, LI Yang

(Institute of Quality Standards and Testing Technology for Agricultural Product, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081)

【Background】Blood product for feeds is a kind of unconventional animal-derived feed material. It is made through coagulating the blood of livestock or poultry, cooking at high temperature, pressing out juice, drying and grinding. However, due to the existence of illegal use of β- agonists, the use of blood product from blood containing β-agonists may become a potential source of harm to human health. In order to reduce the safety risk, it is necessary to study the methods of β-agonists in blood product for feeds. The detection methods of β-agonists include enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), high performance liquid chromatography (HPLC), gas chromatography-mass spectrometry (GC/MS) and liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). At present, most of the methods or standards are aimed at commercial finished feed or animal-derived food, however there is a lack of relevant research on the detection technology of β-agonists in blood product for feeds. 【Objective】In order to study and monitor the status of β-agonists in blood product for feeds, a method of LC-MS/MS combined with solid phase extraction (SPE) was developed for the determination of 18 β-agonists in blood product for feeds.【Method】2 g (accurate to 0.01 g) blood product sample was weighed in 50 mL centrifugal tube, and then 20 mL ammonium acetate extract (pH=5.2) and 50 mL beta-glucuronidase/arylsulfatase were added accurately. The eddies were mixed evenly hydrolyzed overnight at 37 (>16 hours), then centrifuged for 5 min at 8 000 r/min, the supernatant was transferred to another centrifugal tube, and 0.5 mL 30% perchloric acid solution was added. After vortex mixing for 30 seconds and centrifugation for 5 minutes at 8 000r/min, supernatant was reserved. PCX solid phase extraction column was activated with 3 mL methanol and 3 mL water in turn. The supernatant was load and washed by 3 mL water and 3 mL methanol, then drained, eluted by 3 mL 5% ammonia methanol solution. The eluent was blown to near dry by nitrogen at 50 °C, dissolved by 1.0 mL 0.1% formic acid water + acetonitrile solution (95+5) and filtered through 0.22 μm filter membrane, then detected by Waters TQ liquid chromatography tandem mass spectrometer. The column ACQUITY UPLC BEH C18 (100 mm, 2.1 mm, 1.7 μm) was used as analysis column; acetonitrile and 0.1% formic acid solution were used as mobile phase for gradient elution. The ionization modes of mass spectrometry were electron spray ion source, positive ion detection method and multi reaction monitoring (HRM), the spray voltage was 3.5 kV, the dissolvent temperature was 480 °C, the source temperature was 150 °C, flow rate of the dissolvent gas was 600L·h-1, and flow rate of the cone gas was 5 L·h-1. The dissolvent gas, cone gas and collision gas were all high purity nitrogen gas.【Result】18 β-agonists showed a good linear relationship between 5 and 100 μg·L-1, with correlation coefficients ranging from 0.99 to 0.999. The average recovery of blood powder, plasma protein powder and globulin powder was 65.1%-110% at the levels of 5, 10 and 50 μg·kg-1, and the relative standard deviation below 15%. The coefficient of variation between batches was less than 20%. The detection limit was less than 5 ng·g-1.【Conclusion】The results of recovery, precision and actual samples showed that the method was suitable for monitoring β-agonists in blood products for feed.

β-agonists; LC-MS/MS; blood products for feeds

2018-01-08；

2019-09-20

國家自然科學基金（31572443）、公益性行業(農業)科研專項項目（201203088）、農業行業標準制定和修訂（農產品質量安全）項目（2015-332）、中國農業科學院“飼料質量安全檢測與評價”創新團隊項目

索德成，E-mail：suodecheng@caas.cn

（責任編輯 林鑒非）