KDM1A在牦牛卵泡發育過程中的表達

黃向月，熊顯榮，韓杰，楊顯英，王艷，王斌，李鍵

KDM1A在牦牛卵泡發育過程中的表達

黃向月1，熊顯榮2，韓杰1，楊顯英1，王艷1，王斌1，李鍵1

（1西南民族大學生命科學與技術學院，成都 610041；2青藏高原動物遺傳資源保護與利用國家教育部重點實驗室，成都 6100041）

【目的】分析牦牛卵泡發育過程中組蛋白賴氨酸脫甲基酶1（lysine-specific histone demethylase 1A，KDM1A）基因的表達譜，探討KDM1A對牦牛卵泡發育和卵母細胞成熟的影響?！痉椒ā恳躁笈Ｂ雅轂檠芯繉ο?，根據卵泡直徑的大小，將卵泡分為3組：大（6.0—9.0 mm）、中（3.0—5.9 mm）、?。?.0—2.9 mm）卵泡，收集各組別卵泡中卵丘-卵母細胞復合體（cumulus-oocyte complex, COCs）進行體外培養，對不同發育階段卵泡中卵母細胞的體外成熟率進行統計并分析；分別提取各組卵泡卵母細胞及壁層顆粒細胞總RNA，通過實時熒光定量PCR（quantitative real-time RCR, RT-qPCR）方法，檢測KDM1A基因在不同發育階段的卵泡中mRNA相對表達量的變化；采用免疫組織化學技術檢測KDM1A在牦牛卵泡發育過程中的細胞定位及表達規律，并結合體外成熟與RT-qPCR結果進行關聯性分析?！窘Y果】各組卵母細胞體外成熟率與卵泡直徑的大小呈顯著正相關關系，其伴隨卵泡發育的進行呈明顯的上升趨勢，其中大、中、小卵泡組的體外成熟率依次分別為90.53 %、88.10 %、55.14 %。RT-qPCR結果顯示，KDM1A基因在牦牛卵泡發育過程中均有表達，且不同發育階段的mRNA表達水平差異顯著，其中大、中卵泡時期的卵母細胞中的mRNA相對表達量顯著低于小卵泡時期(< 0.05)，而在小卵泡時期的壁層顆粒細胞中的相對表達量極顯著低于大、中卵泡時期 (< 0.01)，在大、中卵泡時期的卵母細胞及壁層顆粒細胞中該基因mRNA表達水平均無差異(> 0.05)。免疫組織化學研究發現KDM1A在大、中、小卵泡壁層顆粒細胞以及膜細胞中均表達，其蛋白表達趨勢與RT-qPCR結果吻合，即隨著發育時間的進行KDM1A表達水平呈上升趨勢，其中在大卵泡時期KDM1A的表達量最高?！窘Y論】在牦牛不同發育時期卵泡的卵母細胞及壁層顆粒細胞中KDM1A mRNA及蛋白的表達水平呈動態變化，提示KDM1A在卵泡發育及卵母細胞成熟過程中發揮重要作用。這可能與卵母細胞的減數分裂及顆粒細胞的增殖分化有關，本研究為進一步研究該基因在牦牛卵母細胞減數分裂過程中的作用機制提供基礎數據。

牦牛；1；免疫組化；卵泡；表達

0 引言

【研究意義】牦牛（）是青藏高原特有的畜種，主要生活在海拔3 000—6 000 m的高寒地區。牦牛是牛屬動物中對低氧環境具有較強適應能力的動物之一，有“高原之舟”之稱[1]。但牦牛性成熟晚，繁殖性能低下，已成為阻礙牦牛產業及高原人民經濟發展的主要因素之一。為此，開展牦牛的繁殖、生產性能等相關研究對提高牧區的生活水平和豐富中國遺傳資源多樣性具有重要意義[2]?！厩叭搜芯窟M展】卵泡與卵母細胞的發育成熟是影響哺乳動物繁殖效率的因素之一[3]。卵泡發育始于胎兒時期，而卵母細胞的最終成熟發生在初情期以后[4]。且其生長和發育與卵泡的發育進程同步，受周圍體細胞（顆粒細胞等）及各種激素的功能活動影響。這些細胞通過間隙連接調節相關激素、蛋白質、代謝物和調節分子，從而促進卵母細胞的發育和成熟[5]。此過程伴隨著表觀遺傳變化。例如，組蛋白H3和H4在減數分裂成熟過程中脫乙?；?，并且H3K4和H3K9甲基化在減數分裂早期表現出動態變化[6-7]。組蛋白賴氨酸甲基化修飾是一個動態的、可逆過程，分別由賴氨酸甲基化轉移酶（KTMs）和去甲基化酶（KDMs）兩個家族催化完成，KDM1A是組蛋白賴氨酸脫甲基酶家族的成員之一。KDM1A是一個黃素腺嘌呤二核苷酸(Flavin adenine dinucleotide, FAD)依賴性胺氧化酶，可特異性脫去組蛋白H3K4me1/2和H3K9 me1/2的甲基。KDM1A又名LSD1、KIAA0601、p110b、BHC110、NPAO，結構分析顯示KDM1A含有SWIRM、Tower以及FAD依賴的單胺氧化酶等結構域[8-9]。功能研究表明，KDM1A定位于細胞核內，通過激活或抑制相關基因的轉錄，在腫瘤發生和胚胎發育過程中均起著重要的作用[10]。近期研究表明KDM1A蛋白及其mRNA在小鼠的各個組織中廣泛表達，該基因通過參與相關基因轉錄激活、染色質調節[11-12]等機制調控相關信號通路來發揮其生物學功能，例如，在小鼠生殖系統中KDM1A主要通過調節周期蛋白的表達來間接調控生殖細胞減數分裂活動[13]?！颈狙芯壳腥朦c】目前對KDM1A基因的研究主要在人、小鼠以及斑馬魚等動物的癌癥及胚胎方面[14-17]，而該基因在牦牛方面的研究還未見相關報道?！緮M解決的關鍵問題】為闡明KDM1A基因在牦牛卵泡及卵母細胞發育過程中的作用，以牦牛卵泡為研究對象，利用RT-qPCR和免疫組化方法檢測KDM1A在卵泡和卵母細胞發育過程中的表達規律，并通過體外培養體系統計不同發育階段卵泡中卵母細胞的體外成熟率，結合RT-qPCR與免疫組化結果進行關聯性分析，為解析KDM1A在牦牛卵泡發育及卵母細胞的成熟過程中的作用機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

微量RNA提取試劑盒（Single Cell-to-CtTMKit）、Trizol Reagent購自Invitrogen（美國）公司，SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒，PrimeScriptTMRT Reagent Kit反轉錄試劑盒、Premix TaqTMDNA聚合酶均購自TaKaRa（大連）公司，胎牛血清（FBS）、Medium培養基購自Gibco公司，雌二醇、促黃體素（LH）、促卵泡生成素（FSH）等購自Sigma公司。熒光定量PCR儀、電泳儀和瓊脂糖凝膠成像系統均購自美國Bio-Rad公司，核酸濃度測定儀購于日本島津。卵母細胞成熟液：M199+10 % FBS+0.01 μg·L-1FSH+0.01 μg·L-1LH+0.001 μg·L-1E2+0.02 ng·L-1EGF。

1.2 樣本采集及處理

樣本均采自成都青白江屠宰場，采集健康的牦牛卵巢。無菌生理鹽水沖洗后將采集的卵巢分為2份進行處理。第一份用4%多聚甲醛固定運回實驗室置于4 ℃備用。第二份投入含Ga2+、Mg2+的生理鹽水（含雙抗），37 ℃保存。運回實驗室用生理鹽水清洗3次，將卵泡根據卵泡直徑大小分成3組：大（6.0—9.0 mm）、中（3.0—5.9 mm）、?。?.0—2.9 mm）卵泡，抽取卵泡液，并置于90 mm的平皿中，在顯微鏡下收集卵丘-卵母復合體（Cumulus-oocyte complex, COCs），卵母細胞成熟液清洗3次。其中收集每組各10個COCs用0.2%透明質酸酶分離得到卵母細胞，并收集各組卵泡液，離心后吸去血細胞，PBS清洗兩次，得到卵泡壁層顆粒細胞，-80 ℃保存備用。剩余COCs用于體外成熟培養，以便進行后續研究。

1.3 卵母細胞體外培養及成熟率觀察

挑選各組卵丘細胞3層以上、形態正常的COCs分別置于含35 mm成熟液的培養皿中，在含5.5%的CO2，38.5 ℃飽和濕度的培養箱中體外培養。成熟培養24 h后，在顯微鏡下觀察卵丘細胞的發散情況，將COCs經0.2%透明質酸酶中消化2—3 min，之后用移液槍吹打去除卵丘細胞，通過觀察是否有第一極體的排出來判定其成熟情況。

1.4 卵母細胞及壁層顆粒細胞總RNA的提取及檢測

Trizol法提取卵泡壁層顆粒細胞RNA，DEPC水處理后應用核酸分析儀檢測濃度和OD值，選取OD值在1.8—2.0之間的RNA作為模板。按照PrimeScriptTMRT Reagent Kit反轉錄試劑盒說明書合成cDNA，并使用GAPDH基因的特異性引物檢測cDNA的質量，將瓊脂糖凝膠電泳結果顯示單一清晰條帶的cDNA置于-20℃保存備用。按照Single Cell-to-CTTMKit試劑盒說明書直接將分離得到的各組卵母細胞合成cDNA，-20℃保存。

1.5 引物設計及合成

根據NCBI已報道的野牦牛（）1（GenBank登錄號：XM_005905175.2）和mRNA序列（GenBank登錄號：AC_000162.1），使用Primer 5.0分別設計引物（表1）。由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

表1 引物信息

F：正向引物；R：反向引物 F: Forward primer; R: Reverse primer

1.6 卵母細胞及壁層顆粒細胞中KDM1A表達分析

采用RT-qPCR檢測KDM1A基因在牦牛不同發育階段卵泡卵母細胞及壁層顆粒細胞中的表達。RT-qPCR反應體系為15 μL，其中SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ7.5 μL，cDNA 1.0 μL，ddH2O 5.5 μL，上、下游引物（10 μmol·L-1）各0.5 μL；PCR擴增條件：預變性94℃，4 min，變性94℃，45 s，退火60℃，1 min，72℃，延伸1 min，35個循環，72℃ 7 min。用2-△△Ct法對定量結果進行均一化處理。

1.7 免疫組化分析

利用免疫組化染色法檢測KDM1A蛋白的表達。將卵巢組織從4 %的多聚甲醛固定液中取出，制成石蠟切片。脫水后置0.88 mol·L-1H2O2中封閉，0.01 mol·L-1PBS（pH7.4）沖洗3次；5 %胎牛血清封閉，滴加一抗（多克隆兔抗KDM1A，BSA100倍稀釋，Abcam公司產品）4 ℃孵育過夜；PBS沖洗3次后滴加二抗（多聚化山羊抗兔IgG，康為世紀公司產品）37 ℃孵育2 h；PBS沖洗后加入DAB顯色，經過蘇木精復染后，脫水、透明、封片，顯微鏡下觀察。圖片利用Image-Pro Plus 6.0進行相對平均光密度分析。

1.8 數據分析

每組試驗至少重復3次，所有試驗數據使用“平均值±標準誤（Mean ± SEM）”表示。采用SPSS軟件進行顯著性分析，<0.01差異極顯著，<0.05差異顯著。

2 結果

2.1 不同發育程度卵泡中卵母細胞的成熟

對不同發育階段卵泡中卵母細胞進行體外成熟培養及成熟率統計分析，結果顯示，中卵泡時期的卵母細胞，卵丘細胞明顯多于小卵泡期，而大卵泡期的卵丘細胞不如中卵泡期致密，部分卵母細胞老化。體外培養大、中、小卵泡中卵母細胞的成熟率依次分別為90.53 %、88.10 %和55.14 %，其中，以小卵泡時期作為參照，大、中卵泡卵母細胞成熟率約為小卵泡成熟率的1.6倍（< 0.01），而大、中卵泡的成熟率相比較差異不顯著（> 0.05）。

2.2 不同發育階段卵泡中KDM1A的表達

利用RT-qPCR，以內參基因作為參照，檢測KDM1A基因在牦牛不同發育階段卵泡卵母細胞及其相應壁層顆粒細胞中mRNA的表達情況（圖1）。結果顯示，在卵泡發育各階段，大、中卵泡時期卵母細胞1的表達水平相差不大（> 0.05），而小卵泡時期的表達水平顯著高于這兩個時期（< 0.05）（圖1-A）。在壁層顆粒細胞中KDM1A基因的表達水平隨卵泡發育的進行呈明顯的上升趨勢，以小卵泡壁層顆粒細胞該基因的表達量作為參考，大、中卵泡的表達量約為小卵泡的3倍（< 0.01）（圖1-B）。

2.3 牦牛卵泡中的KDM1A的定位及表達

由于KDM1A基因在不同發育階段的牦牛卵泡中表達量有顯著差異，本試驗采用免疫組化檢測KDM1A在牦牛不同發育階段卵泡中的定位（圖2）。結果顯示，f牦牛卵泡發育各個階段中KDM1A均有表達，但在不同發育階段卵泡中該基因的表達水平存在差異。黃色或棕黃色著色判定為陽性細胞，主要見于壁層顆粒細胞（GC）、膜細胞（TC）。隨著GC的增殖其熒光信號逐漸增大，直至大卵泡時期的表達量最高，表現為強陽性信號（圖2-C）。其中，大、中卵泡時期的平均光密度顯著高于小卵泡（< 0.05），而大、中卵泡時期相比較差異不顯著（> 0.05）（圖3）。通過RT-qPCR和免疫組化技術分析發現，KDM1A在牦牛不同發育階段的卵泡壁層顆粒細胞中均有表達，且呈現一定的差異性，即隨著發育時間的進行卵泡中KDM1A表達量呈上升趨勢，其中在大卵泡時期KDM1A的表達水平最高。

表1 牦牛卵母細胞成熟度

** 表示差異極顯著（< 0.01） ** Show extremely significant difference (0.01）

** 表示差異極顯著（P < 0.01）；* 表示差異顯著（P < 0.05）

A：牦牛大卵泡組織中KDM1A的定位；B：牦牛中卵泡組織中KDM1A的定位情況；C：牦牛小卵泡組織中KDM1A的定位情況（GC：壁層顆粒細胞；TC：膜細胞）

* 表示差異顯著（P < 0.05）* Show significant difference (P < 0.05)

3 討論

哺乳動物KDM1亞家族有KDM1A和KDM1B兩個成員，它們主要介導H3K4去甲基化[8,18]。其中KDM1A是一種染色質修飾酶，可通過選擇性與核受體的結合催化從H3K4和H3K9中去除甲基化基團[19-20]。組蛋白修飾對哺乳動物的生殖發育至關重要，例如KDM1A與雄激素受體彼此作用，可刺激雄激素受體依賴性轉錄，如抑制該蛋白表達水平會減少雄激素誘導的轉錄激活和細胞增殖，從而影響雄性的生殖發育進程[12]。KDM1A同樣可通過調控相關基因表達介導卵母細胞發育及成熟過程。因此，探索KDM1A在卵泡及卵母細胞的發育成熟過程中的表達規律將為解析牦牛卵母細胞減數分裂機制奠定基礎。

本試驗對不同發育階段牦牛卵泡內的卵母細胞進行體外培養，通過比較卵泡發育程度與卵母細胞成熟度之間的關系分析發現，隨卵泡發育的進行，大、中卵泡卵母細胞成熟度相較于小卵泡時期更高。原因可能為發育成熟的卵泡含有更多的mRNA和蛋白儲存，可增強卵母細胞的發育能力并為其生長提供更好的環境。有研究發現KDM1A通過下調通路的一些拮抗劑，例如DKK1，來激活Wnt/β-catenin通路，可能影響卵泡的發育及排卵能力[21-22]。此外，母源1缺失會導致小鼠二細胞階段發育停滯，且在受精后數周出現顯著的異常表型[23-24]。由此可知，1可能對卵泡卵母細胞及胚胎的發育潛能有一定影響，但有待進一步的研究來驗證。

本試驗采用RT-qPCR的方法檢測了KDM1A基因在牦牛不同發育階段卵泡中的表達水平。結果表明1mRNA在牦牛不同發育階段卵泡內的卵母細胞及其壁層顆粒細胞中均有表達，其中在小卵泡卵母細胞中1高水平表達，之后逐漸降低。這與隨發育進行，體外成熟率升高趨勢正好相反，這可能與卵母細胞減數分裂進程的恢復有關。參照文獻報道， YOKOYAMA[25]等研究確定髓磷脂轉錄因子1（MyT1）是一種新型KDM1A復雜組件。MyT1是神經細胞特異性鋅指因子，它可通過直接與KDM1A相互作用形成穩定的多蛋白復合物發揮相應生物學作用。同時，OH等[26]發現Myt1的下調可能導致部分卵母細胞恢復減數分裂，從而促進其成熟。由此推測，不同成熟率的卵母細胞中KDM1A基因的表達差異可能與其對MyT1的表達調控有關進而參與卵母細胞成熟。此外，1調控小鼠卵母細胞中H3K4me2水平，并調節CDC25B的表達來維持卵母細胞減數分裂阻滯[13]。因此，隨著卵泡的發育，1在卵母細胞中表達降低，可能導致卵母細胞恢復減數分裂，從而進一步成熟，使得大卵泡階段卵母細胞體外成熟率最高，提示1通過調控卵母細胞減數分裂從而參與卵母細胞成熟過程。

在牦牛卵母細胞成熟過程中，卵泡發育程度[27]及顆粒細胞的質量[28]起至關重要的作用。其中，來自不同直徑卵泡的卵母細胞發育能力也有所不同。隨著卵泡的發育，顆粒細胞的增厚，卵母細胞具備的發育能力也會逐漸增強[29-31]。免疫組化檢測發現從小卵泡（1.0—2.9 mm）到大卵泡（6.0—9.0 mm）中的壁層顆粒細胞及膜細胞均表達KDM1A蛋白，且免疫組化結果與實時熒光定量結果吻合，即KDM1A在發育成熟的大卵泡時期表達水平達到峰值。JEESUN等[14]對小鼠卵巢的免疫組化結果顯示，伴隨卵泡的發育，KDM1A在小鼠卵泡顆粒細胞中表達水平升高。這與本結果一致。已有研究證實雌激素通過與顆粒細胞上的雌激素受體（estrogen receptor, ER）結合可以促進顆粒細胞的分化。同時，KDM1A可以通過CAC1蛋白增強雌激素受體（ERα）活性，使其更好的激活相應的靶基因[32]。由此推測，KDM1A在大卵泡壁層顆粒細胞中高表達可能是因為其誘導顆粒細胞的分化，隨顆粒細胞的增多進而促進卵泡的發育過程。綜上所述，可以推測1一方面在卵母細胞中通過表達下調使卵母細胞恢復減數分裂，使卵母細胞成熟；另一方面，在顆粒細胞中通過其表達上調來促進顆粒細胞增殖分化，使卵泡及卵母細胞發育成熟。盡管目前尚不清楚卵巢中KDM1A是如何被調控的，但本結果提示KDM1A參與卵泡與卵母細胞的發育過程，該基因的表達對卵泡發育及卵母細胞成熟有積極作用。

4 結論

在牦牛卵母細胞和壁層顆粒細胞中KDM1A mRNA表達水平隨卵泡發育的進行依次呈逐漸遞減、遞增的趨勢，且其蛋白表達趨勢與RT-qPCR結果吻合。結合不同發育程度牦牛卵泡中存在差異的卵母細胞體外成熟結果，提示KDM1A在卵泡發育及卵母細胞成熟過程中發揮重要作用。這可能與卵母細胞的減數分裂及顆粒細胞的增殖分化有關，為進一步研究該基因在牦牛卵母細胞減數分裂過程中的作用機制提供基礎數據。

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Expression Pattern of KDM1A in the Development of Yak Follicles

HUANG XiangYue1, XIONG XianRong2, HAN Jie1, YANG XianYing1, WANG Yan1, Wang Bin1, LI Jian1

(1College of Life Science and Technology, Southwest Minzu University, Chengdu 610041;2Key Laboratory of Ministry of Education for Qinghai-Tibet Plateau Animal Genetic Resources Reservation and Exploitation, Chengdu 610041)

【Objective】 The aim of this study was to analyze the role of the lysine-specific histone demethylase 1A (KDM1A) in follicle development and oocyte maturation of yak. 【Method】 Taking yak follicles as research objects and according to the size of the follicles, they were divided into three groups: large-sized (6.0-9.0 mm), medium-sized (3.0-5.9 mm), and small-sized (1.0-2.9 mm) follicles. And the cumulus-oocyte complexes (COCs) were collected from each group and cultured in vitro. The maturation rate of oocytes was counted and analyzed. The total RNA was extracted from oocyte and granulosa cells in each group of follicles. The real time quantitative PCR (RT-qPCR) was used to detect the relative expression of1during follicular development. The cell localization and expression of KDM1A in yak follicle were detected by immunohistochemistry, and the correlation analysis was performed by in vitro maturation and RT-qPCR. 【Result】 The maturation rate of oocytes in vitro maturation was positively related to the size of follicles and showed a rising trend with progressing of follicular development. Meanwhile, the oocyte maturation rates of large-sized, medium-sized and small-sized follicle oocytes were 90.53 %, 88.10 % and 55.14 %, respectively. The result of RT-qPCR was found that1gene of yak was widely expressed during the development of follicles, and its expression level was significantly different in developmental stages of follicles. The relative expression of mRNA in the oocytes of the large and medium-sized follicle was significantly lower than small-sized follicles (< 0.05), but the relative expression of granulosa cells in the small-sized follicle was significantly lower than large and medium-sized (< 0.01), and there was no difference in mRNA expression levels between oocytes and granulosa cells in the large and middle-sized (> 0.05). The results of immunohistochemistry showed that KDM1A was expressed in granulosa cells and membrane cells of follicles, and its expression trend was consistent with RT-qPCR. The expression of KDM1A was the highest in the large follicle and increased with the development of follicles. 【Conclusion】 The expression levels of KDM1A mRNA and protein in oocytes and granulosa cells at the development of yak follicles were dynamic, which indicated that KDM1A played an important role in follicular development and oocyte maturation. It might be related to meiosis of oocytes and proliferation and differentiation of granulosa cells, and these results of study would provide a basic data for further research of the mechanism of KDM1A in the meiosis of yak oocytes.

yak;; immunohistochemistry; follicle; expression

2018-12-06；

2019-09-09

國家重點研發專項（2018YFD0502304）、牦牛遺傳資源保護與利用創新團隊（13CXTD01）、青藏高原生態畜牧業協同創新中心開放基金（QZGYXT05）、西南民族大學研究生創新型科研項目（CX2018SZ34）

黃向月，E-mail：1036404671@qq.com。通信00作者李鍵，E-mail：jianli_1967@163.com。通信000作者熊顯榮，E-mail：xianrongxiong@163.com

（責任編輯 林鑒非）