白藜蘆醇通過失活FoxO1及激活Sirt1在IL-1β處理的SW1353細胞中發揮抗骨關節炎效應

顧海倫，徐小磊，劉旭丹，劉莉

（1中國醫科大學附屬盛京醫院骨科；2中國醫科大學公共衛生學院營養與食品衛生教研室，沈陽 110004）

骨關節炎（osteoarthritis, OA）是一種發病率很高的風濕免疫性疾病，主要發生于中老年人。目前，中國有OA患者約1.2億，是老年人致殘的主要原因之一。OA的發病與年齡、肥胖、創傷等許多因素有關，目前并無治愈的有效方法。白藜蘆醇（resveratrol,RES）是一種植物抗毒素，屬于多酚類植物化學物，在葡萄、花生、虎杖中含量豐富。許多文獻報道，RES具有抗OA作用[1]，在防治OA方面具有潛在的應用前景，但其機制仍需探討。

叉頭框轉錄因子O1（forkhead transcription factors O1，FoxO1）是哺乳動物FoxO家族中的一員，幾乎在所有組織中表達[2]，在調控發育、老化、氧化應激等方面發揮重要作用。近年來，FoxO1在OA中的作用也備受關注，據報道，隨年齡增加，軟骨淺表層的FoxO1會顯著減少[3]；在OA軟骨細胞中，過表達FoxO1可以減少炎性介質、減少軟骨降解酶、增加保護性基因表達并拮抗IL-1β的效應，而FoxO1敲除的小鼠OA的發病則顯著增加[4]。

細胞沉默信息調節子1（silent information regulator 1，Sirt1）是NAD+依賴性組蛋白去乙?；?，是治療各種代謝性紊亂如2型糖尿病的主要靶點[5]。Sirt1控制FoxO的核轉位及轉錄活性，并根據靶基因或細胞類型正向或負向調節FoxO的活性[6]。盡管FoxO1和Sirt1之間的關聯在許多疾病中逐漸被闡明，但是在OA中的研究還有待探討。RES是多酚類化合物中Sirt1最強的激活劑，FoxO1-Sirt1之間的關聯是否參與了RES的抗OA作用值得進一步研究。因此，本研究通過體外細胞培養實驗，探討FoxO1-Sirt1之間的關聯在RES抗OA中的作用，為闡明OA的發病機制及尋找有效的營養防治措施提供理論依據。

材料與方法

1 主要儀器和試劑

Multiskan MK3 酶標儀（美國Thermo）；EPS-300電泳儀（中國上海天能科技有限公司）；VE-180垂直電泳槽（中國上海天能科技有限公司）；電泳凝膠成像系統（美國 Bio-Rad公司）；倒置熒光顯微鏡（Leica DMi8）；7500 Real-Time PCR儀(美國 ABI公司 )。RES（美國 Sigma）；IL-1β（美國PeproTech）；ELISA 試劑盒（武漢博士德）；BCA蛋白定量試劑盒、RIPA裂解液（中國碧云天）；βactin、Sirt1抗體（美國Santa Cruz Biotechnology）；FoxO1、p-FoxO1抗體（美國CST公司）；TRITC-山羊抗兔IgG（北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司）；HRP山羊抗小鼠二抗IgG（美國 Earthox）；DAPI（上海碧云天生物技術有限公司）預染蛋白Marker、化學發光底物（美國Thermo）。FoxO1小干擾片段序列（FoxO1 siRNA）及隨機陰性對照序列委托廣州銳博生物科技有限公司合成。

2 細胞培養

SW1353軟骨肉瘤細胞購于中國科學院上海生科院細胞資源中心，采用DMEM完全培養基（含10%FBS和1%雙抗），37℃、5%CO2培養箱中培養；取對數生長期細胞接種于100mm的培養皿中，待融合為單層后進行處理。

3 細胞分組及處理

本研究對細胞的處理共有4個方面，具體為：①將細胞分成對照組（培養基含有2‰ DMSO）、IL-1β組（IL-1β終濃度為10ng/ml）、IL-1β+RES組（IL-1β和RES同時加入培養基中，IL-1β終濃度為 10ng/ml，RES終濃度為12.5或 50μmol/l），處理24h后收集細胞，Western blot法檢測細胞Sirt1水平；②將細胞分為對照組、IL-1β組、IL-1β+RES（50μmol/l）組，處理30 min后收集細胞，免疫細胞化學技術檢測FoxO1的定位表達，Western blot法檢測FoxO1 及p-FoxO1水平；③將細胞分為對照組、陰性對照組、FoxO1 siRNA組。FoxO1siRNA組細胞加入含50nmol/L FoxO1 siRNA的DMEM（10%FBS）無雙抗的培養基，陰性對照組加入含50nmol/L FoxO1 siRNA陰性對照的DMEM（10% FBS）無雙抗的培養基，48h后熒光顯微鏡下觀察轉染效率，Western blot法檢測FoxO1的抑制效果及對Sirt1的影響；④將細胞分為對照組、IL-1β組、IL-1β+RES組、IL-1β+FoxO1 siRNA 組、IL-1β+RES+FoxO1 siRNA組，轉染各組細胞分別加入含50nmol/L FoxO1 siRNA的DMEM（10%FBS）無雙抗的培養基，48h后棄去原培養基，隨后加入含IL-1β（10ng/ml）或IL-1β與RES（50μmol/L）混合的DMEM（0.5% FBS）培養基處理24h，收集細胞和培養基上清，Western blot法檢測細胞Sirt1蛋白表達，ELISA法檢測培養基上清IL-6的水平。

4 siRNA轉染沉默細胞FoxO1基因

取對數生長期細胞，接種于6孔板，1×104細胞/孔。待細胞融合約30%，棄培養基，PBS沖洗3次，轉染，轉染方法和步驟按riboFECTTM CP轉染試劑盒說明進行。首先用30μl 1×riboFECTTM CP Buffer稀釋1.25μl 20μM siRNA儲存液，輕輕混勻，室溫孵育5min；然后制備混合液，加入3μl riboFECTTM CP reagent，輕輕吹打混勻，室溫孵育15min；將riboFECTTM CP混合液加入到465.75μl培養基中，輕輕混勻；置于37℃、5% CO2及飽和濕度條件下繼續培養48h。熒光顯微鏡下觀察轉染效率。

5 ELISA法檢測細胞培養上清中細胞因子IL-6的水平

按照ELISA說明書操作。未稀釋或稀釋后的樣品100μl，37℃反應90 min。反應后甩去酶標板內液體，將生物素抗人IL-6抗體工作液按每孔100μl依次加入，37℃反應60 min；0.01 mol/L PBS洗滌3次，每次浸泡1～2 min；將ABC工作液按每孔100μl依次加入，37℃反應30min；0.01mol/L PBS洗滌5次，每次浸泡1～2 min；每孔依次加入已經在37℃平衡30 min的TMB顯色液90μl，37℃避光反應25min；每孔加入100μl TMB終止液，酶標儀450nm下測定OD值。

6 Western blot檢測蛋白水平

RIPA裂解細胞，BCA蛋白定量，每孔上樣20μg總蛋白，電泳，轉膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1.5h，PBS-T洗膜，一抗（1:1000）4℃過夜，漂洗，二抗（1:5000）室溫2h，漂洗后于ECL成像系統中發光顯影。β-actin做為內參，圖像光密度掃描進行半定量分析。

7 免疫熒光檢測FoxO1定位表達

細胞爬片后用4%的多聚甲醛固定爬片15min，0.2%的Triton X-100室溫通透20min，加山羊血清于濕盒內封閉，室溫孵育30min；取出片子，甩去封閉液，稀釋一抗兔抗人FoxO1（1:100），滴加一抗，覆蓋標本,于濕盒內4℃孵育過夜；第二天取出濕盒后室溫復溫 1h；滴加熒光基團標記的二抗（TRITC-山羊抗兔 IgG，1:100 稀釋）于濕盒內，避光在 37℃孵育 1h；1μg/ml DAPI 復染細胞核，避光復染孵育5min。避光條件下，采用含有防熒光催滅物質的甘油進行封片，立即在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

8 數據分析

采用SPSS 20.0軟件進行統計分析，實驗結果以ˉx±s表示。使用單因素方差分析法比較組間差異，P＜0.05認為差異有統計學意義。

結 果

1 白藜蘆醇上調IL-1β處理的SW1353細胞Sirt1水平

Western blot檢測顯示（圖1），IL-1β處理24h對SW1353細胞Sirt1水平無明顯影響；與IL-1β組相比，同時給予12.5或50μmol/L RES均可顯著增加Sirt1水平；而RES12.5及RES50處理組相比，在對Sirt1蛋白表達方面無明顯差別。

2 IL-1β與白藜蘆醇處理促進FoxO1由胞核向胞質轉位

免疫熒光和DAPI染色顯示，對照組FoxO1主要定位在SW1353細胞的細胞核；經IL-1β或IL-1β與RES共同處理30min后，FoxO1主要在細胞質表達（圖2）。

3 白藜蘆醇增加IL-1β處理SW1353細胞內p-FoxO1水平

Western blot檢測表明，與對照組相比，IL-1β處理30min可以顯著上調SW1353細胞p-FoxO1水平，RES與IL-1β共同處理則進一步增加p-FoxO1水平，但FoxO1總蛋白表達水平在各組間均無明顯差異（圖3）。

4 FoxO1siRNA有效抑制SW1353細胞FoxO1表達

Western blot檢測證明，轉染FoxO1siRNA后，SW1353細胞內FoxO1表達被顯著抑制，抑制率達70%，但轉染陰性對照的細胞其FoxO1表達與對照組（未進行任何轉染的SW1353細胞）相比未見明顯改變（圖4）。

圖1 RES對IL-1β處理的SW1353細胞Sirt1表達的影響。A，Sirt1水平的Western blot檢測；B，Sirt1水平的統計學分析；與對照組比較，*0.01＜P＜0.05；與 IL-1β 組比較，#0.01＜P＜0.05；n=3Fig. 1 Effect of resveratrol on Sirt1 level in SW1353 cells treated with IL-1β. A, Western blot detection for Sirt1 level; B, statistical analysis for Sirt1 level; *0.01＜P＜0.05, compared with the control group; #0.01＜P＜0.05, compared with group IL-1β; n=3

圖2 IL-1β/RES處理對SW1353細胞FoxO1定位的影響。紅色熒光代表FoxO1蛋白表達；藍色熒光代表細胞核被DAPI染色；merge代表前二組圖片融合，表達FoxO1定位表達。比例尺，50μmFig. 2 Effect of IL-1β/RES treatment on FoxO1 location in SW1353 cells. Red fluorescence represents FoxO1 protein expression.The blue fluorescence represents the nucleus stained by DAPI. Merge represents the fusion of the first two groups of images and represents the FoxO1 localization expression. Scale bar, 50μm

5 沉默FoxO1下調SW1353細胞內Sirt1水平

Western blot分析顯示，與對照組相比，陰性對照組Sirt1水平無明顯變化；而相比陰性對照組，轉染FoxO1siRNA的SW1353細胞內Sirt1水平明顯降低（圖5）。

圖3白藜蘆醇對IL-1β處理的SW1353細胞p-FoxO1及FoxO1水平的影響。A，FoxO1水平的Western blot檢測；B，FoxO1水平的統計學分析；與對照組比較，*0.01＜P＜0.05；與IL-1β組比較，#0.01＜P＜0.05；n=3Fig. 3 Effect of resveratrol on the levels of p-FoxO1 and FoxO1 in SW1353 cells treated with IL-1β. A, Western blot detection for FoxO1 level; B,statistical analysis for Sirt1 level; *0.01＜P＜0.05, compared with control group; #0.01＜P＜0.05, compared with group IL-1β; n=3

圖4 FoxO1siRNA沉默 FoxO1表達。A，FoxO1水平的Western blot檢測；B，FoxO1水平的統計學分析；與對照組比較，*0.01＜P＜0.05；與陰性對照組比較，#0.01＜P＜0.05；n=3Fig. 4 FoxO1siRNA silences FoxO1 expression in SW1353 cells. A,Western blotting detection for FoxO1 level; B, statistical analysis for Sirt1 level; *0.01＜P＜0.05, compared with control group; #0.01＜P＜0.05,compared with negative control siRNA group; n=3

6 FoxO1基因沉默降低RES對SW1353細胞內Sirt1的上調

Western blot檢測顯示，與IL-1β組相比，同時給予FoxO1 siRNA預處理并不引起SW1353細胞Sirt1水平明顯變化，進一步加入RES后對Sirt1水平也無顯著影響。與IL-1β+RES組相比，同時給予FoxO1 siRNA預處理則顯著抑制RES對Sirt1水平的上調（圖6）。

7 RES和沉默FoxO1抑制IL-1β對SW1353細胞分泌IL-6的促進作用

ELISA檢測表明，與對照組相比，IL-1β處理可顯著增加SW1353細胞分泌IL-6；在IL-1β處理的同時給予RES或以FoxO1 siRNA沉默FoxO1表達，IL-1β促進IL-6分泌的作用明顯減弱；對同時以IL-1β和FoxO1 siRNA處理的細胞給予RES，IL-1β促進IL-6分泌的作用減弱更為明顯（圖7）。

圖5 沉默FoxO1對SW1353細胞內Sirt1水平的影響。A，FoxO1水平的Western blot檢測；B，FoxO1水平的統計學分析；與對照組比較，*0.01＜P＜0.05；與陰性對照組比較，#0.01＜P＜0.05；n=3Fig. 5 Effect of silencing FoxO1 gene on Sirt1 level. A, Western blot detection for FoxO1 level; B, statistical analysis for Sirt1 level; *0.01＜P＜0.05,compared with control group; #0.01＜P＜0.05, compared with negative control siRNA group; n=3

圖6 沉默FoxO1對白藜蘆醇上調IL-1β處理的SW1353細胞Sirt1水平影響。A，Sirt1水平的Western blot檢測；B，Sirt1水平的統計學分析；與對照組比較，*0.01＜P＜0.05；與 IL-1β 組比較，#0.01＜P＜0.05；與 IL-1β+RES 組比較，$0.01＜P＜0.05；n=3Fig. 6 Effect of silencing FoxO1on upregulation of Sirt1 level by resveratrol in SW1353 cells treated with IL-1β. A, Western blot detection for FoxO1 level; B, statistical analysis for Sirt1 level; *0.01＜P＜0.05, compared with control group; #0.01＜P＜0.05, compared with group IL-1β; $0.01＜P＜0.05,compared with group IL-1β+RES; n=3

圖7 IL-1β、白藜蘆醇和沉默FoxO1對SW1353細胞分泌IL-6影響的統計學分析。與對照組比較，*0.01＜P＜0.05，**P＜0.01；與IL-1β組比較，##P＜0.01；與IL-1β+RES組比較，^0.01＜P＜0.05；與IL-1β+FoxO1 siRNA 比較 , &0.01＜P＜0.05；n=2Fig. 7 Statistical analysis for effect of IL-1β, resveratrol and silencing FoxO1I on IL-6 secretion of SW1353 cells. *0.01＜P＜0.05, **P＜0.01,compared with control group; ##P＜0.01, compared with group IL-1β;^0.01＜P＜0.05, compared with group IL-1β+RES; &0.01＜P＜0.05, compared with group IL-1β+FoxO1 siRNA; n=2

討 論

本研究采用IL-1β作為誘導劑對SW1353細胞進行處理，在體外模擬OA的環境。據報道，OA的軟骨細胞Sirt1表達下調[7]，但本實驗結果發現，IL-1β處理組和對照組的Sirt1表達并無明顯差異，這可能因為SW1353軟骨細胞Sirt1的基線表達水平較低，因此加入IL-1β也顯示不出明顯的降低；但同時給予12.5或50μmol/LRES處理后，則顯著增加Sirt1的表達，說明RES可上調Sirt1表達，進而發揮生物學效應。在我們先前的研究中發現，RES濃度為12.5μmol/L可促進SW1353細胞增殖，而RES濃度為50μmol/L對細胞的增殖無明顯影響[8]，因此在本研究的后續實驗中我們選擇了對細胞增殖無明顯影響的濃度RES 50μmol/L作為處理濃度。

Sisrt1除了通過組蛋白和非組蛋白的脫乙?；{節生理活動外[9]，還靶向調節許多轉錄因子，包括p53，FoxO，E2F1及NF-κB[10]。RES激活SIRT1后，可以通過抑制NF-κB信號通路發揮抗OA效應[11]。此外，Sirt1也通過調控FoxO1發揮作用，FoxO1活性受翻譯后修飾（包括磷酸化和乙?；┱{節，磷酸化的FoxO1從核內轉移至胞質中，使FoxO1不能作用于其靶向基因，從而使FoxO1喪失了其轉錄因子活性[12]；乙?；腇oxO1加速和促進FoxO1的磷酸化，致使FoxO1的活性降低[13]。在氧化應激過程中，FoxO1轉位至細胞核并與Sirt1相互作用，導致FoxO1脫乙?；?。根據FoxO1的翻譯后情況，Sirt1可以抑制FoxO1活性，保護細胞免受氧化應激[14]或增加FoxO1的活性，從而導致基因激活[15]，發揮相應的生物學功能。

關于FoxO1受Sirt1調控的研究很多，本研究則主要探討了RES抗OA效應中FoxO1對SIRT1的調控作用。結果發現，IL-1β處理顯著上調p-FoxO1水平（FoxO1失活增加），而RES處理則進一步增加p-FoxO1的表達，提示RES可以通過增加FoxO1的磷酸化水平引起FoxO1的失活；而FoxO1基因沉默后，在未施加任何處理因素時，Sirt1的蛋白表達也降低，提示Sirt1受FoxO1的調控，與文獻報道一致，即內源性FoxO1是Sirt1的正向轉錄調節子[16]。與IL-1β組相比，FoxO1 siRNA+IL-1β組Sirt1蛋白表達無明顯變化，而RES處理后細胞的Sirt1蛋白表達也無顯著變化，提示RES對Sirt1表達的上調作用是由FoxO1介導。與IL-1β+RES組相比，FoxO1 siRNA顯著降低了Sirt1的水平，進一步表明FoxO1在RES上調Sirt1表達中的重要作用。

外源性IL-1β顯著增加細胞分泌IL-6的水平，而FoxO1基因沉默可抑制IL-1β對IL-6表達的誘導作用，說明抑制FoxO1可以改善SW1353細胞的OA炎癥狀態，而同時給予RES處理則進一步降低了IL-6水平，說明RES的抗OA效應除了與抑制FoxO1/Sirt1有關外，還涉及其他機制。綜上所述，在IL-1β處理的SW1353細胞中，RES可以通過失活FoxO1，增加Sirt1的水平發揮抗OA效應，FoxO1與Sirt1在RES的抗OA效應中存在相互調控關系。因此，對FoxO1-Sirt1信號的調控研究可能有助于進一步闡明OA的發病機制，并可為尋找治療OA的新靶點提供思路。