肌萎縮側索硬化癥小鼠海馬神經元內CaMKII-α減少而CAMKII-β增多

蔣欣 ，管英俊，陳燕春，劉金夢 ，周風華，王巧真，張皓云

(濰坊醫學院，1臨床醫學院，2神經疾病與再生修復實驗室，濰坊261053)

肌萎縮側索硬化癥（amyotrophic lateral sclerosis,ALS）是一種以運動系統損害為特征的神經系統變性疾病，其發病機制尚未闡明[1]。錯誤折疊的超氧化物歧化酶1（superoxide dismutase 1, SOD1）累積所造成的氧化應激異常及神經毒性是ALS發病的重要原因之一[2]。除了運動系統病變外，部分ALS患者也出現認知障礙和進行性海馬病理學改變[3]。

鈣/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶II（calcium/calmodulin-dependent protein kinase-II, CaMK II）是一種多功能蛋白激酶，主要由α和β亞基組成，它們在腦組織中的分布是非神經組織的20～50倍，尤以海馬區更高[4]，但海馬CaMKII-α和CaMKII-β在ALS發病中的作用尚未闡明。本實驗選取模擬ALS的SOD1-G93A轉基因模型小鼠，應用形態學和分子生物學方法檢測海馬中CaMKII-α和CaMKII-β的表達變化及其細胞類型，明確與ALS病變的關系，為從新的角度系統闡明ALS發病機制提供理論依據。

材料與方法

1 實驗動物

SOD1-G93A轉基因小鼠和野生型（wild-type,WT）小鼠，購自Jackson實驗室。按Chen等[5]方法進行基因型鑒定，于發病早期（95d）、中期（108d）和晚期（122d）進行實驗取材。

2 實驗試劑

CaMKII-α兔多克隆抗體，Proteintech公司；CaMKII-β兔多克隆抗體， abcam公司；GAPDH兔單克隆抗體，GAPDH小鼠單克隆抗體，Proteintech Group 公司；Cy3標記的羊抗兔IgG和FITC標記的羊抗小鼠IgG，Jackson Immunoresearch實驗公司；小鼠抗β-tubulinⅢ，R＆D 公司；反轉錄試劑盒，TOYOBO公司。

3 CaMKII-α、CaMKII-β 免疫熒光染色

鼠腦冷凍切片PBS清洗3次，每次5 min，滴加10%山羊血清，37℃孵育40min，甩掉羊血清，分別滴加兔抗CaMKII-α（1:150）和小鼠抗β-tubulinⅢ（1:100）或者兔抗CaMKII-β（1:150）與小鼠抗β-tubulinⅢ（1:100）混合一抗，4℃孵育過夜。次日，PBS清洗5min，重復3次，滴加FITC標記的羊抗小鼠和Cy3標記的羊抗兔熒光二抗（終濃度為1:400），37℃避光孵育40min，滴加Hoechst標記細胞核，37℃避光孵育15min，防淬滅熒光封片劑封片，對照組一抗用PBS代替。在熒光顯微鏡下觀察CaMKII-α、CaMKII-β 及 β-tubulin Ⅲ表達情況。

4 CaMKII-α、CaMKII-β mRNA RT-PCR 檢測

參照Chen等[5]方法進行RNA提取及逆轉錄反應。PCR擴增反應：CaMKII-α上游引物5＇-AGTCAGCCTGCATCGCCTAT-3＇，下游引物5＇-TGTGGAAGTGGACGATCTGC-3＇；CaMKII-β上游引物5＇-TACCGGCCATGAGTATGCAG-3＇，下游引物5＇-GGCGTACAATGTTGGAATGC-3＇；β-actin引物序列見Chen等[5]文章；2 × Flash Hot Start Master Mix 10μl，CaMKII-α 或 CaMKII-β 上下游引物各0.5μl，β-actin上游引物、下游引物各0.5μl，1μl逆轉錄產物作為模板，組成 PCR 反應體系。PCR儀中運行程序:94℃預變性3min，94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共30個循環，72℃延伸5min后冷卻至4℃。瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結果，拍照保存圖像。

5 CaMKII-α、CaMKII-β Western Blot檢測

取ALS小鼠和WT小鼠海馬，加入裂解液冰上裂解30min，期間超聲破碎3次，4℃、12000 rpm/min離心15min，取其上清，檢測蛋白濃度。配制12% SDS-DAGE凝膠，電泳后孵育一抗GAPDH（1:2000）、CaMKII-α（1:800）、CaMKII-β（1:1000），4℃過夜。次日，常溫孵育羊抗小鼠或羊抗兔二抗（1:10000）2h，PBS清洗后滴加ECL孵育，化學發光凝膠成像系統成像，拍照保存圖像。

6 統計學分析

應用IPP6.0圖像分析軟件測量CaMKII-α、CaMKⅡ-β mRNA與β-actin mRNA陽性條帶、CaMKII-α、CaMKⅡ-β蛋白和GAPDH蛋白陽性條帶的光密度值，樣本中目的基因與管家基因mRNA和蛋白光密度值的比值來反映其含量變化。SPSS20.0軟件處理實驗數據，以均數±標準差（x±s）表示計量檢測結果。兩組比較采用獨立樣本t檢驗，當P＜0.05時表示差異有統計學意義。

結 果

1 CaMKII-α定位于海馬神經元且在ALS轉基因小鼠表達降低

免疫熒光分析顯示，在ALS轉基因小鼠與WT小鼠海馬中均可檢測到CaMKII-α免疫陽性細胞，分布在海馬DG區和CA區，并與β-tubulin Ⅲ標記的神經元共存。與WT小鼠相比，CaMKII-α在ALS轉基因小鼠海馬CA區和DG區細胞中免疫反應性95d無明顯變化，108d和122d均明顯降低（圖1）。

RT-PCR檢測顯示，在ALS轉基因小鼠與WT小鼠海馬中均可見CaMKII-α mRNA陽性條帶。與WT小鼠相比，ALS轉基因小鼠海馬CaMKII-α mRNA的變化不明顯。

免疫印跡分析表明，ALS轉基因小鼠與WT小鼠海馬均可檢測到明顯的CaMKII-α蛋白條帶。與WT小鼠相比，ALS轉基因小鼠CaMKII-α蛋白在95d無明顯變化，108d和122d均明顯降低（圖2）。

圖1 108d ALS轉基因小鼠海馬CA區和DG區CaMKII-α表達變化及與β-tubulin III共定位的免疫熒光檢測。比例尺，50μmFig. 1 Immuno fluorescent examination for CaMKII-α expression change and co-localization with β-tubulin III in the CA and DG areas of the hippocampus in 108-day-old ALS mice. Scale bar, 50μm

圖2 ALS轉基因小鼠海馬中CaMKII-α表達變化的Western blot檢測（A）與統計學分析（B）。*，與WT小鼠比較，0.01＜P＜0.05；n = 4Fig. 2 Western blotting (A) and statistical analysis (B) for CaMKII-α expression change in the hippocampus of ALS mice. *, 0.01＜P＜0.05 vs WT mice;n = 4

2 CaMKII-β定位于海馬神經元且在ALS轉基因小鼠表達升高

免疫熒光染色顯示，在ALS轉基因小鼠與WT小鼠海馬中均可檢測到CaMKII-β免疫陽性細胞，分布在海馬DG區與CA區，與β-tubulin Ⅲ標記的神經元共存。與WT小鼠相比，CaMKII-β在ALS轉基因小鼠海馬CA區和DG區細胞中免疫反應性95d無明顯變化，108d和122d明顯升高（圖3）。

圖3 108d ALS轉基因小鼠海馬CA區和DG區CaMKII-β表達變化及與β-tubulin III共定位的免疫熒光檢測。比例尺，50μmFig. 3 Immuno fluorescent examination for CaMKII-β expression change and co-localization with β-tubulin III in the CA and DG areas of the hippocampus in 108-day-old ALS mice. Scale bar, 50μm

RT-PCR分析表明，在ALS轉基因小鼠與WT小鼠海馬中均可見CaMKII-β mRNA陽性條帶。與WT小鼠相比，ALS轉基因小鼠海馬CaMKII-β mRNA的變化不明顯。

免疫印跡結果顯示，ALS轉基因小鼠與WT小鼠海馬均可檢測到明顯的CaMKII-β蛋白條帶。與WT小鼠相比，ALS轉基因小鼠CaMKII-β蛋白在95d呈升高的趨勢，108d和122d均明顯升高（圖4）。

討 論

一般認為ALS是一種運動系統疾病，但臨床上發現部分患者出現運動系統外的癥狀，如癡呆、感覺障礙等，其確切發病機制尚不明確[1]。海馬是大腦內與學習、記憶等高級神經活動有關的結構。臨床研究證明，ALS影響大腦中的皮質下結構，如丘腦、殼核、蒼白球和海馬體[6]。Westeneng等[7]發現，MRI顯示ALS患者海馬體的體積減少，表明海馬可能參與ALS神經退行性過程。Quarta等[8]發現，SOD1-G93A突變的ALS小鼠海馬中間神經元的減少會導致焦慮樣行為和選擇性學習障礙的發生。

大多數CaMKII全酶是α/β異源體，α/β為3:1，且二者比率具有可變性[4]。研究表明，阿爾茲海默癥發病過程中，神經突觸CaMKII活性的降低發揮重要作用[9]。本實驗以CaMKII為突破點，探究ALS轉基因小鼠海馬中CaMKII-α和CaMKII-β的變化。實驗結果顯示，與WT小鼠相比，ALS轉基因小鼠海馬中CaMKII-α蛋白在發病過程中降低，而CaMKII-β蛋白則升高。提示CaMKII-α蛋白和CaMKII-β蛋白的異常表達與ALS發病相關。

Thiagarajan 等[4]發現，CaMKII-α 和 CaMKII-β的比率隨神經元活動性增加而增大，神經元活動性降低而減小。體內神經突觸根據對谷氨酸和γ-氨基丁酸敏感性的不同可分為興奮性神經突觸和抑制性神經突觸，興奮性突觸使突觸后膜去極化導致神經元興奮性升高，抑制性突觸通過陰離子門控通道使突觸后膜超極化導致神經元興奮性降低。研究發現，在體內CaMKII的α亞單位只表達在興奮性中間神經元，但是β亞單位除表達在興奮性神經元外，也表達于抑制性中間神經元[10]。研究證明，記憶形成過程取決于CaMKII-α與受體結合的持續作用，并未發現有CaMKII-β的作用[11]。本實驗發現CaMKII-α蛋白在ALS發病過程中降低，CaMKII-β蛋白則升高，該結果與Thiagarajan等研究結果一致。CaMKII-α和CaMKII-β mRNA水平沒有發生改變，而蛋白水平有變化，推測這種現象可能是受到miRNA的調節所致。MiRNA是約22個核苷酸的小RNA，與許多mRNA上的互補區域結合，促進它們的降解并抑制它們的翻譯。Zhou等[12]發現mir-124可通過靶向調控ALS轉基因小鼠中的下游基因來調節神經干細胞的分化，下游基因蛋白水平顯著改變，mRNA水平保持不變，表明ALS病變過程有miRNA的參與。Kocerha等[13]研究發現，C57BL/6J小鼠中mir-219具有負性調節CaMKII的作用。

圖4 ALS轉基因小鼠海馬中CaMKII- β表達變化的Western blot檢測（A）與統計學分分析（B）。*，與WT小鼠比較，0.01＜P＜0.05；n= 4Fig. 4 Western blotting (A) and statistical analysis (B) for CaMKII- β expression change in the hippocampus of ALS mice. *, 0.01＜P＜0.05 vs WT mice;n = 4

CaMKII作為Wnt非經典通路下游重要信號分子，參與調控Wnt信號通路。Wnt信號通路在短期調控海馬神經元活動中發揮重要作用。本課題組前期研究發現，多種Wnt信號分子在ALS轉基因小鼠腦組織中表達異常[14,15]。CaMKII表達變化與Wnt信號通路的關系及其在ALS發病中的作用機制有待進一步闡明。