葉酸誘導腎損傷的小鼠腎組織水通道蛋白表達隨病程遷延而減少

邢佳，黃宇穎，陳慧云，王愷悅，翟效月*

（1中國醫科大學組織胚胎學系，2中國醫科大學第二臨床學院，沈陽110122）

葉酸（folic acid, FA）誘導腎損傷模型目前被廣泛應用于研究腎小管來源的急性（2d）轉慢性（14d）腎損傷與腎小管間質纖維化的發病機制。隨著FA晶體快速出現在腎小管中，其本身的直接細胞毒性及物理堵塞導致管狀上皮細胞損傷[1]。腎臟作為調節機體水平衡的主要器官，水通道蛋白(aquaporin,AQP)的主要成員AQP-1和AQP-2在上述腎損傷模型中的變化尚無報道。

正常腎臟中，AQP-1主要表達于近端小管、長髓襻降支細段的細胞膜游離面及側基底面，以及髓質直小血管下降支內皮細胞膜上，介導原尿中60%～80%水分的吸收[2-4]； 而AQP2主要表達于連接小管及集合管主細胞游離面細胞膜或胞質內囊泡[5,6]。在順鉑誘導的大鼠多尿模型中，AQP-1和AQP -2表達明顯降低[7]。但是，免疫組織化學技術顯示大多數病變腎臟的腎小球及腎小管上AQP-1表達上調[8,9]，這表明不同損傷導致腎損傷部位及病理改變不同。

在FA誘導急性轉慢性腎損傷模型中尚無相關研究。本研究通過檢測AQP-1和AQP-2在FA誘導腎損傷后2d、7d、14d的表達水平變化，探討AQP在FA腎損傷模型中的作用及對腎小管水重吸收的調節能力。

材料與方法

1 實驗動物及FA誘導腎損傷模型的建立

C57BL/6雄性小鼠（6周齡）購買自遼寧長生生物，在標準SPF級環境飼養一周后造模。造模當日上午8:00稱量體重。于11:00予以腹腔注射FA 250mg/kg（溶于0.3mmol/L NaHCO3）。小鼠飼養于（21±1）℃，濕度 50%±10%的環境，保持 12h 的明/暗光照周期，并提供充足的水和食物，分別于2d、7d、14d時在代謝籠中收集24h尿液，待麻醉后眼球取血，經心臟灌流取腎臟，每個時間點各10只。本動物實驗按照世界醫學會倫理標準，并獲得中國醫科大學醫學倫理委員會批準。

2 實驗試劑

抗體：兔抗AQP1抗體（ab65837，Abcam，Cambridge，UK）、兔抗AQP2抗體（A7310，Sigma）；山羊抗兔（P450，DAKO，Glostrup，Denmark）；

試劑：葉酸（F7876，sigma）、牛血清白蛋白（A1933，Sigma）、DAB試劑盒（ZLI-9017，北京中杉金橋），糖原PAS染色試劑盒（G1281，索萊寶，中國）。

3 腎臟石蠟切片標本制備

實驗小鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉（2mg/kg）。麻醉后，通過心臟灌流4%多聚甲醛后取出腎臟，置于4%多聚甲醛連續固定48h，取出修塊，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟定向包埋，石蠟切片機（徠卡 RM2245, 德國）制備3～5μm切片。

4 PAS染色

將正常對照鼠、FA 2d、FA 7d、FA 14d小鼠腎臟石蠟切片置于二甲苯中脫蠟，高至低濃度乙醇水化，蒸餾水洗3次，每次5min。切片置于氧化劑（試劑A）中，室溫放置6min，后經自來水洗2min，蒸餾水浸洗2次，暗室環境下置于Schiff Reagent（試劑B）浸染15min，自來水洗10min。置于蘇木素中染色液（試劑C）中1min，酸分化液中（試劑D）分化3s，自來水洗10min，使其返藍，逐級梯度增高乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。

5 Masson染色

將正常對照鼠、FA 2d、FA 7d、FA 14d小鼠腎臟石蠟切片脫蠟、水化后，蒸餾水洗3次，每次5min。切片置于Masson麗春紅酸性復合染液中15min，0.2%醋酸浸洗3次。以5% 磷鎢酸溶液分化7min，0.2%醋酸洗3次，后經甲苯胺藍染3min，0.2% 醋酸浸洗3次，逐級梯度增高乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。

6 免疫組織化學染色檢測AQP-1和AQP-2表達特點

將正常對照鼠、FA 2d、FA 7d、FA 14d小鼠腎臟石蠟切片脫蠟、水化，PBS洗3次，每次5min。切片經微波修復抗原（檸檬酸鹽修復液），常溫下PBS（3% BSA、0.05%皂苷、0.2%明膠、PH7.4）預孵育30min后，滴加AQP-1抗體（1:1500）和AQP-2抗體（1:1500），濕盒內4℃過夜。室溫PBS洗3次，3% H2O210min封閉內源性過氧化物酶，PBS（0.1% BSA）洗3次，每次10min。隨后滴加山羊抗兔（1:200），常溫下孵育1h，PBS滴洗3次，每次10min。蒸餾水洗5min，DAB顯色1～3min，蘇木素復染25s后1%鹽酸酒精分化3s，流水沖洗20min返藍，經梯度乙醇和二甲苯脫水、透明、中性樹脂封片。以PBS代替一抗作陰性對照，最終在顯微鏡（Nikon90i，日本）下采集圖像。

結 果

1 FA誘導腎損傷模型鼠的腎組織結構發生破壞及其變化特點

PAS和Masson染色結果顯示，正常對照組刷狀緣及基底膜均為紫紅色染色，代表糖原或糖蛋白沉著（圖1A）。與正常對照組相比，FA 2d的腎皮質及外髓外帶近端小管受損嚴重，表現為結構紊亂、細胞腫脹并呈現水變性及空泡變性，崩解的細胞碎屑與刷狀緣脫落于管腔（圖1B）。相較于FA 2d和FA 7d皮質小管結構恢復至接近正常，小管上皮較正常組薄，管腔擴大，管周間隙增大，胞質少，且胞質及核均濃染（圖1C）。FA 14d皮質淺層及中層小管普遍擴張，近端小管結構再次紊亂，與FA 2d相似，而髓放線中遠端及集合管結構排列整齊，類似于FA 7d恢復中的近端小管，即管腔擴張、管壁變薄，胞質及核深染（圖1D）；此時，PAS陽性的小管基底膜增厚，而Masson染色顯示管周間隙中纖維成分有沉積，呈藍色（圖1D）。

圖1 PAS及Masson染色顯示腎臟組織結構。A，正常對照組PAS染色，插入框為對應Masson染色局部圖；B，FA 2d PAS染色；C，FA 7d PAS染色；D，FA 14d PAS染色，插入框為Masson染色局部圖；星號，近端小管；雙黑箭頭，刷狀緣脫落；單黑箭頭，基底膜間斷性斷裂；白箭頭，上皮細胞水變性和空泡變性；無尾黑箭頭，增寬的管周間隙；比例尺，25μmFig. 1 Renal microstructure of normal and FA induced renal injury mice with PAS and Masson staining. A, PAS staining of control group, insert box corresponding to local Masson staining figure; B, PAS staining of FA 2d; C, PAS staining of FA 7d; D, PAS staining of FA 14d, insert box corresponding to local Masson staining figure；asterisk, proximal tubule; double black arrows, deciduous brush border; single black arrow, discontinuous rupture of basement membrane; white arrow, hydropic and vacuolar degeneration in the epithelial cells; tailless black arrow, widened interstitium between tubules;scale bar, 25μm

2 FA誘導腎損傷模型鼠腎的AQP-1和AQP-2表達變化規律

正常小鼠中，AQP-1表達于近端小管的腔面和側基底面及髓襻降支細段，在皮髓質中，廣泛分布于微動脈內皮細胞膜表面，包括髓質中的直小血管下降支（圖2A1）；而AQP-2則表達于皮質中的連接小管及貫穿皮髓質走行的集合管主細胞表面（圖2A2）。

圖2 正常及FA誘導腎損傷模型鼠腎的AQP-1和-2免疫組織化學染色。A1和A2，分別為正常對照鼠腎AQP-1和-2表達； B1，C1和D1，分別為FA 2d、FA 7d、FA 14d AQP-1表達；B2，C2和D2，分別為FA 2d、FA 7d、FA 14d AQP2表達；黑箭頭，損傷嚴重近端小管和集合管細胞幾乎不表達AQP-1和AQP-2；白箭頭，AQP-2在集合管頂部的胞質部分表達明顯增多；比例尺，25μmFig. 2 Immunostaining of AQP-1 and AQP-2 in the kidney of FA induced renal injury mice and normal mice. A1 and A2, immunohistochemical staining of AQP-1 and AQP-2 in control normal mice, respectively; B1, C1 and D1, immunohistochemical staining of AQP-1 in the kidney of FA induced renal injury mice on FA 2d、FA 7d、FA 14d, respectively; B2, C2 and D2, immunohistochemical staining of AQP-2 in the kidney of FA induced renal injury mice on FA 2d、FA 7d and FA 14d, respectively; black arrow, almost nonexistent of AQP1 and AQP-2 in seriously damaged proximal tubule and collecting tubule cells; white arrow, AQP-2 was signi ficantly increased in cytoplasmic portion at the apical part of the collecting duct principal cells; scale

FA 2d時，皮質及外髓外帶結構紊亂的近端小管上皮細胞仍然表達AQP-1，但空泡變性嚴重的細胞則無AQP-1表達。內髓直小血管及髓襻降支細段的AQP-1表達不受影響，甚至呈現增強。此時，AQP-2在集合管主細胞上的表達未受明顯累及，幾無變化（圖2 B1與B2）。

相較于FA 2d和FA 7d皮質的小管損傷較之前減輕，AQP-1僅弱表達在結構相對較好的近端小管腔面，包括外髓外帶；但基底側面陽性更弱。此時，AQP-2在集合管從皮質到髓質都呈強陽性。

FA 14d時，皮質及外髓小管結構再度紊亂；與FA 2d相比，此時腎組織間質細胞成分增加，小管管壁變薄，以至于很難區分小管節段。整個皮髓質AQP-1僅在少量殘存的上皮細胞呈弱陽性表達。此時，集合管較FA 7d時顯著擴張，AQP-2在主細胞表達增強，且在頂部的胞質部分明顯增多。

討 論

葉酸誘導腎損傷模型目前被廣泛用于研究急性腎損傷及慢性間質纖維化，盡管其與碳酸氫鈉混合使用可堿化尿液而減少結晶形成導致的小管堵塞，但其本身的直接毒性及結晶導致的小管堵塞仍使管狀上皮細胞受到損傷[10,11]，因此，FA常被用于研究以腎小管毒性損傷為主要來源的急性（FA 2d）轉慢性（FA 14d）腎損傷的模型，而且FA誘導劑量高低與腎損傷程度密切相關。

本研究中，FA 2d時出現腎小管結構紊亂，尤其以近端小管為嚴重，出現大量水變性甚至空泡變性的上皮細胞，而集合管未受到明顯累及，提示腎臟損傷處于急性期[12]。此時，近端小管仍然表達AQP-1，且由于細胞塌陷，其表達可能會表現得較強，但部分管腔已經被崩解的上皮細胞填塞，加之細胞呈現變性改變，功能會削弱，臨床上仍會表現為少尿。當腎小球濾過液在近端小管未能被重吸收時，細段和直小血管下降支為適應損傷，維持正常尿液的濃縮功能，反而增強了AQP-1的表達。

FA 7d時，腎組織結構恢復到接近正常，近端小管變性壞死的細胞較FA 2d減少。此時，近端小管結構雖然完整，但是胞質少，故上皮變薄，胞質及核濃染，AQP-1弱陽性表達，提示小管正經歷自我修復。此外，與正常結構不同的是，管周間隙擴大，可能與急性損傷期部分塌陷的小管無法修復導致腎單位萎縮或丟失有關。

FA 14d時，AQP-1在近端小管的表達持續減少，髓質的表達雖增強但陽性小管數目卻減少，此時，集合管主細胞受到累及，集合管較FA 7d擴張，少量細胞出現空泡變性，此時AQP-2不僅表達在主細胞細胞膜，在頂部的胞質部分也明顯增多，這可能是因為AQP2在細胞內囊泡表達升高，以適應損傷。然而，即使幸存的小管細胞再生修復，但潴留的FA仍持續損傷小管，且部分損傷小管上皮細胞可能轉分化形成肌成纖維細胞，分泌細胞外基質。因此，Masson染色可見沉積的膠原纖維，提示損傷的腎可能已經形成纖維化[12,13,14]，進一步加重了近端小管、降支細段和集合管損傷，此時，AQP-1和AQP-2的表達均明顯減少。

綜上所述，FA誘導腎損傷模型中，近端小管損傷較集合管早，急性損傷后壞死的上皮細胞不再表達AQP-1，殘存的近端小管及降支細段的上皮細胞通過增強AQP-1表達以適應損傷，在形態學上也觀察到腎臟在FA 7d有短暫的修復期。然而，持續的損傷導致腎臟修復不良，集合小管也受累，AQP-2代償性的在殘存集合小管細胞內囊泡的表達升高。表明AQPs參與了腎小管來源的急性（FA 2d）轉慢性（FA 14d）腎損傷的發病機制，這為深入研究腎損傷的水平衡能力提供了新的途徑。