中華蟾蜍登陸后消化道嗜銀細胞形態和分布密度的增齡變化

汪寅，汪子怡，劉溯源，伍亮，陳頤佳，張志強

（1安徽農業大學動物科技學院動物醫學系，2安徽農業大學動物科技學院動物科學系，3安徽農業大學動物科技學院水產養殖學系，合肥 230036）

兩棲動物幼體水生生活，成體登陸生活，生活史過程不但經歷了水陸環境的轉換，也涉及內部器官萎縮、重建和改造等過程[1]。其中，變態前后消化器官的大小具有可塑性[2]，消化道內分泌細胞的出現時序、分布位置和密度也隨變態過程而波動，具有物種特異性[3-7]。嗜銀細胞是消化道內分泌細胞的總稱，廣泛分布于各類無脊椎動物和脊椎動物[8-9]。兩棲動物成體嗜銀細胞的形態學特征受季節、冬眠狀態或饑餓等因素的影響較小，但分布位置和密度變幅較大[10]。目前，對登陸后不同年齡階段兩棲動物消化道嗜銀細胞形態和分布密度的比較研究，只見于花背蟾蜍（Pseudepidalea raddei）[11]。本文采用Grimelius銀染法結合微波改良技術[12]，比較了幼體、亞成體和成體雄性中華蟾蜍（Bufo gargarizans）消化道嗜銀細胞的形態學特征，以及同一年齡組嗜銀細胞分布密度的部位差異、同一部位嗜銀細胞分布密度的年齡差異，為中華蟾蜍消化生理學研究提供形態學基礎。

材料和方法

1 實驗材料

于2018年7月中下旬在安徽省合肥市包河區大圩鎮曉南村（117.38°E、31.76°N）池塘中捕捉中華蟾蜍，分別捕獲成體、亞成體和幼體雄蟾各8只，暫養于塑料箱（40 cm × 50 cm × 90 cm）內不超過24h。第二天，用電子天平稱量動物的體重（±0.001 g），直尺測量體長（± 0.1 cm）。幼體的體重為（8.763 ± 0.945）g，體長為（4.6 ± 0.1）cm；亞成體的體重為（21.325 ± 0.392）g，體長為（6.3 ±0.1）cm；成體的體重為（70.425 ± 5.089）g，體長為（8.9 ± 0.2）cm。之后用雙毀髓法處死動物，解剖分離消化道，并去除內容物，截取0.3～1cm 長的食道、賁門、胃底、幽門、十二指腸、空腸、回腸和直腸各段組織，固定于10%的中性甲醛溶液48h以上，蒸餾水水洗后，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，用輪轉切片機（浙江省金華市科迪儀器設備有限公司，型號：KD-2258）切片厚5μm。

2 結合微波技術的Grimelius嗜銀細胞染色法

參照伍亮等[11]對花背蟾蜍消化道嗜銀細胞的染色方法，結合微波處理技術[12]，對不同年齡組中華蟾蜍消化道各段進行銀染處理。其基本過程如下：石蠟切片經二甲苯和梯度乙醇處理脫蠟至水后浸入1%的硝酸銀水溶液，在微波爐（Media EP210）中中火加熱5min，溫度保持為58～60℃，之后用60℃的蒸餾水清洗銀染后的切片，并轉入已60℃預熱0.5h新鮮配制的還原液中，在微波爐中還原5min后，自來水充分沖洗切片3min，去除附著在切片上的殘留物，終止還原反應，再經蒸餾水水洗5min后，常規梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，37℃烘干后，鏡檢觀察。

3 嗜銀細胞計數與拍照

使用Motic-BA 210型顯微鏡進行觀察、計數和拍照，顯微鏡放大倍數為400 ×。每只幼體中華蟾蜍食道、賁門、胃底、幽門、十二指腸、空腸、回腸和直腸等部位都隨機選取1張切片，每張切片隨機計數3個400 ×視野，以3個視野中嗜銀細胞數量的平均值表示每一部位嗜銀細胞的分布密度，取8只幼體的平均值表示幼體該部位嗜銀細胞的分布密度。亞成體和成體嗜銀細胞分布密度的計數方法同幼體。

4 統計分析

用SPSS 19.0 for Windows進行數據處理。用雙因素方差分析（Two-way ANOVA）統計不同年齡組和消化道不同部位嗜銀細胞分布密度的組間差異及年齡和部位的交互作用。用單因素方差分析（Oneway ANOVA）及多重比較（Multiple comparisons）post hoc test統計幼體、亞成體和成體中華蟾蜍消化道不同部位嗜銀細胞分布密度的差異，以及不同年齡組消化道同一部位嗜銀細胞分布密度的差異。文中數據均以平均值 ± 標準誤（Mean ± SE）表示，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

結 果

1 消化道嗜銀細胞形態學特征的增齡變化

閉合型或開放型細胞都主要分布于消化道粘膜上皮和腺體中。閉合型嗜銀細胞呈圓形或橢圓形，幼體主要分布于食道（圖1A）和胃底（圖1B），幽門（圖1C）、十二指腸（圖1D）、空腸和回腸偶見；亞成體十二指腸（圖1E）和胃底（圖1F）數量較多，幽門（圖1G）和回腸（圖1H）偶見；成體胃底（圖1I）和賁門數量較多，回腸和直腸（圖1J）偶見。

開放型嗜銀細胞呈錐體形、燒瓶狀、蝌蚪狀、短棒狀或長棒狀，主要分布于幼體、亞成體和成體的胃底（圖1K-M），幽門（圖1N）、回腸（圖1O）、回腸和直腸（圖1P）偶見。

2 年齡和消化道部位對嗜銀細胞分布密度的影響

中華蟾蜍消化道嗜銀細胞的分布密度既有年齡差異（F2,168= 4.947,P＜0.01），也有部位差異（F7,168= 8.581,P＜0.01），但年齡和部位之間無交互作用（F14,168= 1.128,P＞0.05）。

圖1 中華蟾蜍消化道嗜銀細胞形態學特征的增齡變化。A，幼體食道圓形的嗜銀細胞；B，幼體胃底圓形的嗜銀細胞；C，幼體幽門橢圓形的嗜銀細胞；D，幼體十二指腸橢圓形的嗜銀細胞；E，亞成體十二指腸橢圓形的嗜銀細胞；F，亞成體胃底橢圓形的嗜銀細胞；G，亞成體幽門橢圓形的嗜銀細胞；H，亞成體回腸橢圓形的嗜銀細胞；I，成體胃底橢圓形的嗜銀細胞；J，成體直腸橢圓形的嗜銀細胞；K，幼體胃底長棒狀的嗜銀細胞；L，亞成體胃底錐體形的嗜銀細胞；M，亞成體胃底燒瓶狀的嗜銀細胞；N，幼體幽門長棒狀的嗜銀細胞；O，亞成體回腸蝌蚪狀的嗜銀細胞；P，成體直腸短棒狀的嗜銀細胞。EP，上皮；SG，胃腺；箭頭示嗜銀細胞；比例尺，15μmFig.1 Age-related changes in morphological characters of argyrophil cells along the digestive tract of Bufo gargarizans. A, round shaped argyrophil cells in the esophagus of juvenile toads; B, round shaped argyrophil cells in the fundus of juvenile toads; C, ellipse shaped argyrophil cells in the pylorus of juvenile toads; D, ellipse shaped argyrophil cells in the duodenum of juvenile toads; E, ellipse shaped argyrophil cells in the duodenum of sub-adult toads; F, ellipse shaped argyrophil cells in the fundus of sub-adult toads; G, ellipse shaped argyrophil cells in the pylorus of sub-adult toads; H, ellipse shaped argyrophil cells in the ileum of sub-adult toads; I, ellipse shaped argyrophil cells in the fundus of adult toads; J, ellipse shaped argyrophil cells in the rectum of adult toads; K, long bar shaped argyrophil cells in the fundus of juvenile toads; L, pyramid shaped argyrophil cells in the fundus of subadult toads; M, flask shaped argyrophil cells in the fundus of sub-adult toads; N, long bar shaped argyrophil cells in the pylorus of juvenile toads; O,tadpole-like shaped argyrophil cells in the ileum of sub-adult toads; P, short bar shaped argyrophil cells in the rectum of adult toads. EP, epithelium; SG,stomach gland; arrows indicating argyrophil cells; scale bar, 15μm

幼體和亞成體十二指腸的分布密度都高于成體（F2,21= 4.463,P＜0.05），食道和腸道各段均隨年齡增加而趨于減少，幽門趨于增加，賁門先升后降，但均無年齡差異（表1）。

幼體胃底的分布密度顯著高于其他消化道各段（F = 5.320,P＜0.01），但其他各段間均無顯著差異；亞成體胃底和賁門顯著高于幽門、空腸、回腸和直腸（F7,56= 2.189,P＜0.05），食道和十二指腸與其他消化道各段均無顯著差異；成體胃底和賁門顯著高于腸道各段（F7,56= 3.128,P＜0.01），食道和幽門與其他消化道各段均無顯著差異（表1）。

表1 中華蟾蜍消化道嗜銀細胞分布密度的年齡和部位變化（單位：細胞個數/400×視野）Tab. 1 Age-related and segmental changes in distribution densities of argyrophil cells along the digestive tract of Bufo gargarizans (unit: cells/400× fields)

討 論

幼體、亞成體和成體中華蟾蜍消化道嗜銀細胞形態的增齡變化不明顯，成體十二指腸的密度低于幼體和亞成體，不同年齡組都在賁門和胃底密度較高，這可能與各年齡組的消化生理特性及十二指腸的功能狀態有關。

1 嗜銀細胞形態學特征的增齡變化

中華蟾蜍消化道嗜銀細胞廣泛分布于登陸后的不同年齡段，形態上可分為閉合型細胞和開放型細胞，閉合型細胞呈圓形或橢圓形，開放型細胞多呈棒狀、錐體形等形狀，嗜銀細胞的多種形態可能與切片所切位置有關，也可能與物種分類地位或消化生理狀態有關[10]。研究表明，北方狹口蛙（Kaloula borealis）消化道嗜銀細胞形態多為圓形[13]，而黑龍江林蛙（Rana amurensis）[14]和中國林蛙（Rana chensinensis）[15]多呈錐體形和梭形。中華蟾蜍消化道嗜銀細胞的形態學特征未見明顯的增齡變化，可能主要依賴數量變化來適應年齡的增長和可變的消化生理狀態。

2 消化道同一部位嗜銀細胞分布密度的增齡變化

成體中華蟾蜍十二指腸嗜銀細胞的分布密度低于幼體和亞成體，其他消化道各段隨年齡增加而增加或減少,或者呈波浪狀波動,但各部位均無明顯的年齡差異。兩棲動物消化道嗜銀細胞及其分泌的主要激素的出現時間隨物種而變化，但通常隨發育進程而增多[11]，這與消化功能的逐漸發育和完善有關。例如，處于變態發育30～46期的極北鯢（Salamandrella keyserlingii），食道、胃和小腸中的嗜銀細胞分別見于第43、42和41期[7]。50日齡前，小鼠十二指腸、回腸和盲腸嗜銀細胞的密度高峰分別見于20、20和5日齡[16]。登陸后，幼體和亞成體中華蟾蜍攝食量相對較大、生長快速，十二指腸嗜銀細胞分布密度的大幅度提升有助于加快對食物的消化和吸收過程。然而，幼體、亞成體和成體中華蟾蜍空腸和直腸生長抑素細胞的分布密度卻均隨年齡增加而顯著增加，但十二指腸無明顯的年齡差異[17]，提示嗜銀細胞所包含的多種內分泌細胞的分布密度可能存在不同的增齡模式。

3 同一年齡組消化道不同部位嗜銀細胞分布密度比較

中華蟾蜍的身體大小不受短期禁食和重喂食的影響，但消化器官大小隨食物條件而變化[18]?；ū丑蛤苡左w、亞成體和成體消化道嗜銀細胞的分布密度都在食道最高，密度低谷分別出現于賁門和空腸、直腸、胃底、十二指腸、空腸和直腸[11]。不同年齡組中華蟾蜍消化道嗜銀細胞呈波浪形分布，且都在胃部分布密度較高，這可能與感知食物刺激和促進食物下行有關，此后上升或下降的內分泌細胞數量可能與個體的消化生理狀態或內分泌細胞內顆粒的周期性排出有關。對小鼠腸道的研究表明，內分泌細胞數量的波浪形波動可能與細胞內顆粒的周期性排出有關，部分內分泌細胞顆粒的全部釋放與消化功能的調節有關，因此會導致內分泌細胞數量的減少[16]。

總之，登陸后中華蟾蜍消化道嗜銀細胞的形態學特征無明顯改變，主要依賴嗜銀細胞數量的增減來滿足不同年齡段消化和吸收營養物質的能力。