三氯生對雌性斑馬魚肝胰臟凋亡相關基因表達的影響

劉旭昊，祖恩普，王 凡

（洛陽師范學院，河南 洛陽 471000）

三氯生（Triclosan，TCS）化學名稱為2,4,4′-三氯-2′-羥基二苯醚，微溶于水，易溶于有機溶劑和堿液。為廣譜抗菌劑和殺菌劑，廣泛應用于肥皂、牙膏、化妝品等個人護理品，醫療殺菌劑等醫療用品，纖維產品、絲質產品等紡織用品中。隨著日用消費品的大量使用，TCS 廣泛存在于自然界中，現已于污水處理廠、污泥、河口、河流等檢測到TCS，在污水處理廠進、出水濃度分別高達86.2、2.7 μg/L，自然河流和沉積物中分別高達2.3、2.7 μg/kg[1]。由于TCS 具有一定的穩定性、生物蓄積性和弱毒性等特點，其潛在威脅已經成為國內外研究焦點之一[1-4]。目前，關于TCS 毒理學研究已有大量報道，李林朋等[5]在TCS 對人體肝細胞DNA 損傷研究中證實，低濃度TCS 會導致DNA 損傷。鄭欣等[6]研究表明，TCS 會導致生物體組織發生突變和癌變，并對生物體內分泌系統有干擾性。陳建軍等[7]研究發現，TCS 對硬骨魚類有潛在遺傳毒性和生理毒性。迄今，關于TCS 對鯉科魚類肝胰臟細胞凋亡影響的研究報道較少。

斑馬魚（Danio rerio）為一種常見的模式生物，廣泛用于遺傳、藥理學、毒理學和環境監測等領域的研究[8-9]。肝臟是魚類的重要代謝器官和解毒器官，可在魚類早期發育過程中降低外來毒物的毒性效應[10]。本研究以斑馬魚為材料研究TCS 對雌性斑馬魚肝胰臟凋亡相關基因表達的影響，有助于揭示TCS 對硬骨魚類肝胰臟損傷的相關分子機制，為水體中TCS 的污染管控提供基礎數據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

實驗用斑馬魚購于上海誠信漁場，體長1.5～2.1 cm。將斑馬魚放在60 L 水族箱中馴養，不間斷充氧（DO ＞ 5 mg/L），每天早晚各投食1 次，并定時清理食物殘渣和魚的排泄物，每天換水1 次，換水量為1/2，馴養用水為曝氣72 h 的自來水。水溫(22±3) ℃，pH 6.8±0.2。整個馴養期間斑馬魚無死亡。取馴養的體質量 (0.06 ± 0.01) g、體長 (1.62±0.31) cm、行動比較敏捷活潑、狀態較佳的魚進行慢性TCS 暴露實驗。

1.2 實驗試劑

TCS，美國Sigma，純度 ＞ 98.0%；二甲基亞砜（DMSO），天津紫明化工有限公司；2 g/L TCS母液，由DMSO 溶解TCS 配制而成；總RNA 極速抽提試劑盒，上海飛捷生物技術有限公司；反轉錄試劑盒，日本東洋紡生物科技有限公司；BestarSybr Green qPCR master mix，德國DBI 公司；引物序列由華大基因合成。

1.3 實驗設計

TCS 對斑馬魚96 h 半致死濃度（LC50）為0.34 mg/L[11]，據此，設置一個空白對照組和3 個質量濃度分別為0.017、0.034、0.068 mg/L 的TCS 處理組，3 個處理組分別用TCS 母液配制而成，濃度分別為LC50的1/20、1/10、1/5?？瞻讓φ战M和處理組中DMSO 體積分數為0.07%。每組設置兩個平行組，每個水族箱水量為20 L，投放斑馬魚100 尾；水質指標同馴養。然后以半靜態染毒法（每天換水10 L，同時補充相應的染毒液）對斑馬魚進行連續染毒。每天定時投放飼料及清除排泄物。

1.4 樣本的制備

斑馬魚生命周期為4 個月左右，本暴露實驗采用2 月齡斑馬魚。為探討TCS 對斑馬魚從幼齡階段到成齡階段肝胰臟細胞凋亡的影響，因此進行了42 d 的TCS 連續染毒試驗，暴露試驗結束時，每缸死魚尾數均小于5%，且染毒組和對照組無顯著差異。然后，選出生長狀況良好的斑馬魚進行解剖。每個濃度組取6 個樣本（兩個平行缸分別取3 個樣本），每個樣本由隨機取的5 尾雌性斑馬魚的肝胰臟組成。然后迅速轉移并保存在超低溫冰箱中用于后期凋亡相關基因表達的檢測。

1.5 凋亡相關基因表達的檢測

1.5.1 引物序列β-actin、Bax、MDM2、p53和Bcl-2基因的引物序列參考文獻[12]，詳見表1。

表1 PCR 引物序列Table 1 Sequences of PCR primer

1.5.2 RNA 的提取與反轉錄 按照總RNA 極速抽提試劑盒提供的方法，提取雌性斑馬魚的肝胰臟組織總RNA。用凝膠電泳分析RNA 質量，并用超微量分光光度計檢測其純度。對質量好且純度高的RNA 樣本進行反轉錄反應。

1.5.3 普通PCR 將反轉錄所得cDNA 加入目的基因和內參基因的上下游引物，2×Taq MasterMix 及無菌水，制備25 μL 反應體系，根據普通PCR 步驟進行擴增。用瓊脂糖凝膠電泳檢測各基因的表達結果。

1.5.4 實時熒光定量PCR 用實時熒光定量PCR儀分析各基因溶解曲線發現，內參β-actin及目的基因Bcl-2、p53、MDM2和Bax基因熔解曲線均為單峰，且單峰橫坐標均為相同熔解溫度，因此引物特異性良好，可以用來進行實時熒光定量PCR 反應。

用cDNA、目的基因和內參基因的上下游引物、BestarSybr Green qPCR master mix 及無菌水制備20 μL 的實時熒光定量PCR 反應體系，放入實時熒光定量PCR 儀中進行擴增。

從實時熒光定量PCR 擴增后的數據中提取熒光信號到達設定的閾值時所經歷的循環數（CQ值），用2-ΔΔt法計算目的基因的相對表達。采用最小顯著差數法（LSD 法）分析對照組與處理組之間的差異，顯著性水平α為0.05 或0.01。

2 結果與分析

2.1 目的基因和內參基因擴增

PCR 擴增結果如圖1 所示，經比較各濃度組各基因與內參基因，以及同一基因對照組和TCS 處理組灰度值之比，發現p53在TCS 各處理組的表達升高；Bcl-2、MDM2和Bax基因表達降低。

2.2 三氯生對雌性斑馬魚凋亡相關基因表達的定量分析

如圖2 所示，各TCS 濃度組Bcl-2基因與對照組相比表達極顯著下調，0.017、0.034、0.068 mg/L組依次下調97.98%、75.97%、99.51%。各TCS 濃度組p53基因與對照組相比表達極顯著上調，在TCS 濃度為0.017 mg/L 時上調最為明顯，上調21.79倍。質量濃度為0.034、0.068 mg/L 時分別上調12.46倍和12.24 倍。

圖1 不同TCS 濃度組內參及目的基因的表達Fig.1 Expression of genes in the groups with different TCS concentration

各TCS 濃度組MDM2基因與對照組相比均呈現極顯著下調，0.017、0.034、0.068 mg/L 組依次下調99.26%、92.78%、75.69%。與對照組相比，TCS處理組的Bax基因亦極顯著下調，0.017、0.034、0.068 mg/L 組依次下調94.26%、99.63%和98.89%。

同時，從圖2 的結果也可以看出，Bax/Bcl-2比值呈現先升高，后下降再升高的趨勢。

圖2 TCS 對雌性斑馬魚肝胰臟凋亡相關基因表達的影響Fig.2 Effect of TCS on expression of apoptosis-related genes in female zebrafish hepatopancreas

3 討論

3.1 TCS對斑馬魚肝胰臟中Bcl-2 與Bax 表達的影響

脊椎動物細胞凋亡是由多種基因共同控制的細胞程序性死亡，是維持生物正常生理過程和功能活動所必須的。Bcl-2 蛋白家族是細胞凋亡的重要調節蛋白。Bcl-2基因是一種抑制細胞凋亡的基因，位于內質網中，其表達量直接或間接影響內質網釋放Ca2+，抑制凋亡[13]，從而保護細胞免受凋亡[14-15]。Bax基因為Bcl-2 家族的主要促凋亡基因。Bcl-2與Bax形成一個調控系統：當Bax形成同源二聚體時會誘導細胞的凋亡；而當細胞中的Bcl-2增多時會與Bax形成更加穩定的Bax-Bcl-2異源二聚體，從而中和Bax的促凋亡作用[16]。在本研究中，TCS 處理的雌性斑馬魚肝胰臟中Bcl-2與Bax的表達量均顯著下降。這可能是由于TCS 染毒液抑制了Bcl-2基因的表達，因Bcl-2基因表達的減少導致內質網釋放大量的Ca2+，從而促進細胞的凋亡。這與劉林等[17]的納米氧化鋅對斑馬魚鰓中Bcl-2基因表達量影響的結果相一致。有研究表明，Bax/Bcl-2比值的升高可促進細胞凋亡的發生。本研究中Bax的表達量也極顯著下調，但Bax/Bcl-2比例呈現先升高后下降再升高的趨勢，進一步證實低濃度和高濃度組TCS 促進了斑馬魚肝胰臟細胞凋亡的發生。

3.2 TCS 對斑馬魚肝胰臟MDM2 和p53 表達的影響

MDM2基因是p53調控網絡中的下游基因，參與細胞的生長、凋亡和細胞周期等生命過程，對維持生命活動的穩定有重要作用。MDM2可與p53的N 端區域結合，從而抑制其轉錄，并可將p53運出細胞核進入細胞質而降解[18-19]。p53為抑癌因子，其產物對多種下游基因有調節作用[20,21]。它在調控復雜的DNA 損傷系統中起轉錄因子作用，DNA 的損傷會引起p53表達量增高，其產物會激活下游抑制細胞周期素依賴性激酶活性，從而抑制細胞周期的進程[22]。本研究中，經TCS 處理的斑馬魚MDM2基因的表達量均顯著下降，而p53基因的表達顯著升高，在TCS 質量濃度為0.017 mg/L 時表達量最高，為對照組的20 倍。這進一步證實了TCS 加速雌性斑馬魚肝胰臟細胞凋亡的發生，與周迎芳等[23]的F-2 毒素對小鼠卵巢細胞凋亡影響結果一致。

綜上，0.017 mg/L 的TCS 顯著影響了雌性斑馬魚肝胰臟凋亡相關基因的表達，進而可能導致肝胰臟細胞凋亡的發生。該濃度高于自然河水中的最高質量濃度2.3 μg/L，但低于污水處理廠進水質量濃度86.2 μg/L，表明隨著這類抗菌劑的大范圍應用，可能會對水生態系統產生影響。