基于MethylMix法探索結腸癌甲基化驅動基因

康爭春，朱良亮，閆飛虎，于恩達

結腸癌是發病率逐年上升的我國乃至世界最常見的消化道惡性腫瘤之一[1]。隨著經典的腺瘤-癌模型的提出，大量基因突變和轉錄組學標志物的發現，表觀遺傳學的提出、研究、應用，結腸癌的分子調控機制越來越趨于完善。但目前已知的分子標記只能部分解釋結腸癌的發生、發展、轉歸、預后。因此，繼續探索發現結腸癌分子標記，以提高對結腸癌的認識，對于結腸癌的研究是非常必要的。

表觀遺傳學在不改變DNA編碼序列的情況下，對基因的表達與功能產生可遺傳的表型，其應用于結腸癌的診斷、治療的前景非常廣闊。DNA甲基化是表觀遺傳修飾的一種重要形式，異常的DNA甲基化可改變染色質結構及癌基因和抑癌基因的表達，最終參與腫瘤的發生發展[2]。因此，通過對DNA甲基化的檢測，篩選甲基化驅動基因，可加強對結腸癌表觀遺傳修飾的認識，為進一步探索結腸癌表觀遺傳學調控機制提供借鑒。

本研究利用來自腫瘤基因組圖譜(the cancer genome atlas，TCGA)的甲基化及表達譜數據，確定了甲基化驅動基因并進行功能富集分析，分析了甲基化驅動基因富集的功能和通路。這些發現將有助于進一步提高對結腸癌的表觀遺傳修飾機制的認識。

表1 差異甲基化和與基因表達相關性Top20驅動基因

1 資料與方法

1.1 組織樣本數據下載及預處理 從癌癥基因組圖譜(TCGA，https://cancergenome.nih.gov/)搜索并下載結腸腺癌450kIlluminaInfinium甲基化陣列、基因表達譜數據。去除表達譜或甲基化數據為0的基因。

1.2 甲基化驅動基因的篩選 在R.3.5.0環境下，使用程序包MethylMix[3]進行甲基化驅動基因篩選，驅動基因需要滿足的條件為：(1)基因甲基化和基因表達具有顯著相關性;(2)結腸癌組織樣本和結腸正常組織樣本的甲基化水平具有顯著性差異。過濾條件為：矯正P<0.05，相關系數r<-0.3。MethylMix進行甲基化驅動基因篩選的基本原理如下：(1)通過對結腸癌組織樣本基因甲基化水平和基因表達水平相關性的計算，篩選出具有顯著相關性的基因；(2)對癌組織和正常樣本的甲基化程度構建一個混合模型，利用Wilcoxon rank test發現癌組織樣本和正常組織樣本之間具有顯著差異的甲基化基因；(3)對上述2者取交集，并對基因P值進行矯正，最后取矯正P<0.05的基因為甲基化驅動基因。

1.3 甲基化驅動基因可視化 在R.3.5.0環境下，使用程序包MethylMix，對符合篩選條件的上述甲基化驅動基因繪制差異甲基化和基因甲基化與基因表達相關性圖形，并對甲基化驅動基因進行聚類分析。

1.4 甲基化驅動基因的功能通路富集分析 將甲基化驅動基因通過DAVID Bioinformatics Resources (https://david.ncifcrf.gov/,versionn 6.8)做GO富集分析，通過KOBAS3.0 (http://kobas.cbi.pku.edu.cn/)做KEGG通路富集分析。高度富集的GO功能或KEGG通路被認為是甲基化驅動基因的潛在功能。

2 結果

2.1 組織樣本的一般情況 共有308個結腸癌組織樣本納入研究，均含有基因甲基化及表達譜數據；共有38個結腸正常組織樣本納入研究，均含有基因甲基化數據。對308個結腸癌組織樣本的甲基化數據的gene symbol和表達譜數據的gene symbol取交集，共有21 091個gene symbol納入研究。

2.2 基于MethylMix法的甲基化驅動基因篩選結果共發現323個甲基化驅動基因，其前顯著性前20的甲基化驅動基因為ZNF43、FAM72B、CAHM、CTD-2245F17.3、AP000251.3、DPY19L2、RP11-710C12.1、AC005498.3、ZNF568、DMRTA1、FAM200A、CTC-444N24.13、ANKRD18B、ZNF614、GREB1L、HSPA1A、ZNF730、RP11-573G6.4、DOK5、CMTM3等。

2.3 甲基化驅動基因可視化結果 代表性的甲基化驅動基因的差異甲基化與表達相關性的代表性圖例如圖1～4所示。 AC009237.8基因在癌組織中相對于正常組織高甲基化，并且其甲基化程度與mRNA表達呈顯著性負相關，揭示結腸癌該基因的高甲基化可能造成其表達降低，該基因可能為結腸癌的抑癌基因，由于其高甲基化造成抑癌基因被抑制或失活。AREG基因在癌組織中相對于正常組織低甲基化，并且甲基化程度與表達水平呈負相關，揭示該基因可能作為結腸癌的原癌基因，由于其低甲基化造成原癌基因活性增高，促進結腸癌的發生、發展。圖5為甲基化驅動基因的聚類分析熱圖，從圖中不難看出，結腸癌癌組織與正常組織甲基化驅動基因有著明顯的表達水平差異，在CHL1、CD34、BNIP3、SUSD5等基因表現的尤為明顯。

圖1 AC009237.8基因在癌組織中相對于正常組織高甲基化

圖2 AC009237.8基因甲基化程度與表達水平呈負相關

圖3 AREG基因在癌組織中相對于正常組織低甲基化

圖4 AREG基因甲基化程度與表達水平呈負相關

圖5 甲基化驅動基因聚類分析熱圖

2.4 功能富集分析結果 為了了解甲基化驅動基因在結腸腺癌生物學中的作用，本研究通過功能通路富集分析對甲基化驅動基因功能進行了富集分析。通過對甲基化驅動基因篩選結果，對甲基化驅動基因GO和KEGG進行功能通路富集分析，推斷差異甲基化基因潛在的生物學過程。筆者發現這些甲基化驅動基因可能與轉錄的調控、DNA模板、金屬離子鍵結合、轉錄因子活性、結合DNA、核酸結合、代謝途徑、癌癥途徑等信號有關(圖6和圖7)。這提示甲基化驅動基因在結腸腺癌的生物學過程中起著重要作用。

圖6 GO功能富集結果

圖7 KEGG通路富集結果

3 討論

當今醫學正在進入精準醫學模式，個體化治療可以使結腸癌患者最大可能的治療獲益，結腸癌是一種分子水平異質性很大的惡性腫瘤，分子分型的差異很大程度上決定了患者的個體化治療方案[4-7]，雖然目前對于結腸的分子機制研究日新月異，但由于結腸癌調控機制的復雜性，目前對于結腸癌的精細調控通路目前尚不完善。因此需要對結腸癌發生、發展過程中的關鍵分子做更加深入的挖掘，獲得敏感性、特異性更高的生物標志物。

經大量研究與實驗證實，表觀遺傳學的調控在惡性腫瘤的發生發展中發揮著重要作用，尤其是DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質重塑、非編碼RNA等表觀遺傳學的調控。而目前DNA甲基化是最重要，也是科研工作者研究的最為廣泛的一種表觀修飾方式。大量的DNA甲基化改變在結腸癌的發生、進展過程中出現，直接影響結腸癌的生物學行為，并且DNA甲基化是結腸癌能夠最早分辨出的表觀改變[8]。然而，目前對于在結腸癌發揮重要作用的甲基化驅動基因，腫瘤科研工作者的認識仍舊很少。

目前已經證實DNA甲基化異常在結直腸癌[9]、胃癌[10]、肝癌[11]、乳腺癌[12]、前列腺癌[13]、黑色素瘤[14]等惡性腫瘤的發生、發展中起著重要作用。CCNEI、CCNDBP1、PON3、DDX43、CHL1等目前已知的甲基化異?；?，經證實其在重要的細胞生命活動如增殖、分化、遷移、凋亡過程中發揮重要作用的同時，也直接影響結腸癌患者疾病的進展與預后[15-16]。但由于各種局限性，如技術水平不一致、研究分散等，所以目前對結腸腺癌整體的甲基化驅動基因認識尚未形成，因此要更全面地挖掘與整合結直腸癌甲基化驅動基因。

MethylMix[3]是2015年Gevaert發現的一種鑒定甲基化異?；虻乃惴?，并在R語言中整合為R包，為鑒定甲基化異常提供了一種高效的工具。其基本原理為引入β混合模型區分甲基化水平差異，進而與正常組織的甲基化水平做差異比較，最后與基因的表達譜數據匹配，挖掘有顯著差異的甲基化異?；?。本研究主要借助MethylMix的R包，利用TCGA公共數據庫，對TCGA數據庫結腸腺癌患者組織樣本甲基化陣列及表達譜數據進行分析研究，篩選出了如ZNF43、FAM72B、CAHM、CTD-2245F17.3等323個甲基化驅動基因，其中高甲基化的基因共有283個，如ZNF43、FAM72B、CAHM、CTD-2245F17.3、AC009237.8等，其在癌組織中相對于正常組織高甲基化，并且其甲基化程度與mRNA表達呈顯著性負相關，揭示結腸癌基因的高甲基化可能造成其表達降低，可能為結腸癌的抑癌基因，由于其高甲基化造成抑癌基因被抑制或失活；其中低甲基化的基因共有40個，如RP11-2C24.7、ZHX1-C8orf76、LINC00944、SLPI、AREG等，它們在癌組織中相對于正常組織低甲基化，并且甲基化程度與表達水平呈負相關，揭示該類基因可能作為結腸癌的原癌基因，由于其低甲基化造成原癌基因活性增高，促進結腸癌的發生、發展。對323個甲基化驅動基因進行GO功能和KEGG通路富集分析，揭示了甲基化驅動基因的潛在功能，如轉錄的調控、DNA模板、金屬離子鍵結合、轉錄因子活性、結合DNA、核酸結合、代謝途徑、癌癥途徑等。顯示MethylMix法在甲基化驅動基因篩選上的科學性、高效性，挖掘的甲基化驅動基因對于以后的結腸癌甲基化驅動基因的基礎研究起到參考意義。

綜上所述，應用MethylMix法挖掘甲基化驅動基因并進行功能分析，這些發現有助于深入認識結腸癌表觀遺傳學調控機制，并有可能作為診斷的生物標志物和治療靶點應用于臨床。