營參合劑預防暈動病的實驗研究

吳慧文，張宏偉，顧 偉，李 敏

當暴露于異常加速度環境，人體會出現眩暈、頭痛、出冷汗、惡心、嘔吐、持續性疲勞等癥狀，統稱為暈動病[1]。其主要由暈船、暈機、暈車以及視覺誘發所產生[2]。雖然暈動病的發生機制至今沒有完全闡明，但已有證據表明，機體暴露于異常加速度環境所引起的應激反應、植物神經系統功能異常是促使暈動病發生發展的重要原因[3]。不少實驗證實，現有的多種抗暈動病藥物，如東莨菪堿等，可以緩解惡心、嘔吐等暈動病主要癥狀，但對植物神經系統功能異常以及持續性疲勞沒有緩解作用[4]。有意義的是，有研究發現提高糖皮質激素信號通路的活性能夠增強機體對異常加速度的耐受能力[5]。近期，在人群試驗中還發現，與暴露前相比，異常加速度暴露15 min后，其血清胰島素含量平均下降33%、血糖平均升高24%、血清丙酮酸、β-羥基丁酸分別平均升高309%和201%[6]。此外，筆者通過動物實驗結果證實，注射胰島素或采用特殊營養素增加內源性胰島素分泌量可明顯緩解加速度暴露所致的血糖、血清丙酮酸、β-羥基丁酸的升高幅度，緩解疲勞。在上述研究結果的基礎上，本研究組配制了以具有調節糖皮質激素信號通路、活性確切的傳統中藥——人參的活性成分(Rb1、Rg1)和具有刺激胰島素分泌功效的營養素(葡萄糖、酪氨酸、亮氨酸)為主要功能成分的營參合劑[7]。本研究擬通過動物實驗觀察其預防暈動病的效果?，F報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組與處理

雄性SD大鼠(SCXK2013/0016)，購自Sino-British SIPPR/BK實驗動物中心，體質量(287±20)g，4只大鼠為1籠，飼養室溫度保持(23±2)℃，提供12 h光照、12 h黑夜的變化周期，保持飼養室內干凈衛生，提供充足衛生的飲食飲水。適應1周后，按數字表法隨機分為對照組、加速度暴露組(暴露組)、加速暴露+東莨菪堿給藥組(東莨菪堿組)、加速度暴露+營參合劑干預組(營參合劑組)4個大組，每組32只大鼠。每個大組進一步分為曠場、Morris水迷宮、負重游泳實驗和血生化指標檢測4個亞組，均設置在暴露后，每個亞組8只大鼠，實驗期間無死亡。對照組和暴露組大鼠灌胃生理鹽水，東莨菪堿組大鼠灌胃東莨菪堿水溶液，營參合劑組大鼠灌胃營參合劑水溶液，灌胃劑量均為2 ml/只。東莨菪堿水溶液制作方法：蒸餾水稀釋東莨菪堿至0.2 mg/ml(購自aladdin公司，批號 H1507073)[12]。營參合劑水溶液制作方法：葡萄糖0.4 g(購自VETEC公司，批號WXBC2393V)，酪蛋白0.3 g(購自MACKLIN公司，批號C10052764)，亮氨酸0.1 g(購自VETEC公司，批號 WXBB1226V)， Rb1 3.3 mg(購自TREBIO公司，批號YT1658978)，Rg1 3.3 mg(購自TREBIO公司，批號YT1687897)，溶于1 ml蒸餾水。灌胃30 min后，除對照組外，其余各組大鼠均進行加速度暴露2 h。暴露結束后即刻，各組大鼠按照計劃分別進行曠場、Morris水迷宮和負重游泳實驗，生化指標檢測亞組大鼠則立刻斷頭處死，取血清備用。本實驗遵循國家衛生研究所實驗動物護理使用指南以及實驗動物福利指南。

1.2 大鼠加速度暴露方法

加速度暴露裝置根據Crampton等[13]報道制成。將大鼠無束縛地放入旋轉刺激裝置的有機玻璃籠內，繞水平軸順時針旋轉，以16°/s2的角加速度從0加速至120°/s，立即以48°/s2的角加速度減速直至旋轉停止。經歷1 s暫停后，容器繼續以上述方式逆時針方向旋轉。如此順時針-暫停-逆時針循環。1個循環大約持續21 s。

1.3 暈反應指數評分標準

研究證實，異常加速度暴露后大鼠因植物神經系統功能異常而引起排便、排尿增加以及立毛、震顫等癥狀，其嚴重程度與大鼠暈動病的嚴重程度相關，因此研究者提出可采用暈反應指數作為大鼠暈動病嚴重程度的判斷指標[8]。參照文獻[8]提供的方法，計數加速度暴露過程大鼠排出的糞便顆粒數，每粒糞便計1分；有排尿則計1.2分，無排尿不計分；若有輕度立毛現象的計0.6分，重度計1.2分；有震顫現象計1.2分。暈反應指數為各項得分的總和。

1.4 血清激素和生化指標檢測方法

所有的生化檢測均重復2次。

1.4.1 血清激素含量 血清皮質醇、腎上腺素、去甲腎上腺素、胰高血糖素以及血糖水平升高，胰島素水平降低是機體應激反應的主要表現[9]。通過檢測血清中這些激素的水平來觀察加速度暴露后大鼠是否處于應激狀態，同時觀察東莨菪堿和營參合劑對加速度暴露引起的應激反應是否有保護作用。采用放射免疫法 (試劑盒購自北方生物技術研究所)檢測大鼠血清胰島素、胰高血糖素和皮質醇水平，采用酶聯免疫吸附 (ELISA) 法(試劑盒購自美國Zymo Research公司)檢測大鼠血清腎上腺素、去甲腎上腺素水平。

1.4.2 血清丙酮酸、β-羥基丁酸、血糖水平 前期研究發現人體經歷加速度暴露后血清丙酮酸、β-羥基丁酸水平大幅度升高。雖然存在爭議，但大多數學者認為體內丙酮酸、β-羥基丁酸蓄積與疲勞發生發展有關[10-11]。采用ELISA法(試劑盒購自南京建成生物科技有限公司)檢測大鼠血清丙酮酸、β-羥基丁酸水平。采用羅氏血糖儀檢測大鼠血糖值。

1.4.3 三磷酸腺苷(ATP)水平 ATP作為機體直接的能量來源，其濃度直接影響多種人體功能，反映了機體疲勞狀態。因此，本研究檢測了各組大鼠的海馬、前額皮層、肝臟、肌肉組織中ATP水平。采用ATP分析試劑盒(試劑盒購自南通碧云天生物技術公司)檢測大鼠ATP水平。

1.5 腦力和體力疲勞評價指標檢測方法

用曠場活動距離、水迷宮找平臺時間來評價大鼠的腦力疲勞狀態[12]，用負重游泳時間來評價大鼠的體力疲勞狀態[13]。所有實驗均重復3次。

1.5.1 曠場實驗 參照文獻[14]提供的方法，大鼠放入曠場實驗裝置(RD1112-IFO-R-4, Mobiledatum, Shanghai, China)，裝置使用的是黑色長方體箱(長：40 cm，寬：40 cm，高：90 cm)，將大鼠輕柔地放在敞開的中心區域內。(每次1只)放入后立即蓋蓋，計算機自動記錄大鼠在暗箱中活動情況。使用軟件(EthoVision XT 8.5，Noldus，Netherlands)統計每只大鼠5 min內在箱子內活動的總距離(cm)。

1.5.2 Morris水迷宮 參照文獻[14]提供的方法，水迷宮直徑1.5 m，高0.6 m。注入水深0.4 m，水溫23～24 ℃。水池劃分為東南、東北、西南和西北4個象限。在1個選定的象限中放入1個直徑為10 cm的平臺(臺面在水面下1 cm)。大鼠有90 s的時間在水中尋找平臺，如果在90 s內未能找到，將由實驗人員指引至平臺并停留30 s。大鼠每日接受3次連續訓練。經過訓練的各組大鼠在加速度暴露后立即依次分別放入4個象限(時間間隔5 min)尋找到平臺。使用軟件(EthoVision XT 8.5，Noldus，Netherlands)記錄每只大鼠分別從4個象限放入池中找到平臺時間，4次的平均值為該大鼠找平臺時間(s)。

1.5.3 負重游泳實驗 參照文獻[15]提供的方法，1 m×0.5 m玻璃箱，水深0.85 m，水溫23～24 ℃。大鼠尾巴負重物為其體質量4%。秒表記錄從入水到力竭的時間(min)做為大鼠負重游泳能力指標。大鼠超過10 s未能浮出水面呼吸即可判斷其為力竭表現。

1.6 統計學處理

實驗數據用GraphPad Prism v6.0(GraphPad Prism Inc., La Jolla, CA, USA)軟件進行處理，數據以均數±標準差(x±s)表示。各指標組間比較采用獨立樣本t檢驗。P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠暈反應指數比較

暴露組大鼠的暈反應指數(8.58±2.75)與對照組(1.48±1.43)相比顯著升高(P<0.05)；與暴露組相比，東莨菪堿組的暈反應指數(3.35±1.83)和營參合劑組大鼠的暈反應指數(5.55±1.16)上升幅度有不同程度的緩解(P<0.05)。上述結果表明，加速度暴露前服用東莨菪堿和營參合劑均可以明顯緩解實驗動物的暈動病嚴重程度，東莨菪堿的效果更優于營參合劑。

2.2 各組大鼠腦力和體力疲勞相關指標比較

與對照組比，暴露組大鼠曠場活動總距離顯著縮短(P<0.05)，Morris水迷宮找平臺時間顯著延長(P<0.05)，負重游泳時間顯著縮短(P<0.05)。這表明加速度暴露導致大鼠出現明顯的腦力和體力疲勞。與暴露組相比，東莨菪堿組大鼠加速度暴露后的腦力和體力疲勞指標沒有明顯變化，但營參合劑組大鼠曠場活動總距離顯著延長(P<0.05)，水迷宮找平臺時間明顯縮短(P<0.05)，負重游泳時間明顯延長(P<0.05)。這些結果表明提前服用營參合劑能在一定程度上預防加速度暴露大鼠腦力和體力疲勞的發生。見表1。

注：與對照組比aP<0.05；與暴露組比bP<0.05；與東莨菪堿組比cP<0.05

表2 各組大鼠血糖和血清應激激素含量比較(x±s，每組n=8)

注：與對照組比aP<0.05；與暴露組比bP<0.05；與東莨菪堿組比cP<0.05

2.3 各組大鼠血糖和血清激素水平比較

與對照組比，暴露組大鼠血清胰島素水平降低(P<0.05)，血糖、皮質醇、胰高血糖素、腎上腺素、去甲腎上腺素水平升高(P<0.05)。與暴露組相比，東莨菪堿組大鼠上述血清激素水平沒有明顯變化，但營參合劑組大鼠血清胰島素水平明顯高于暴露組和東莨菪堿組，血清皮質醇、腎上腺素、去甲腎上腺素和胰高血糖素水平則明顯低于暴露組和東莨菪堿組。上述實驗結果表明，異常加速度暴露引起實驗大鼠出現明顯的應激反應，加速度暴露前服用東莨菪堿對加速度暴露大鼠的應激反應沒有明顯的影響，而加速度暴露前服用營參合劑可以明顯緩解加速度暴露大鼠應激反應的強烈程度。見表2。

2.4 各組大鼠血清丙酮酸和β-羥基丁酸水平比較

與對照組比，暴露組大鼠血清丙酮酸水平和β-羥基丁酸水平明顯升高(P<0.05)。與暴露組大鼠相比，東莨菪堿組大鼠血清丙酮酸和β-羥基丁酸水平無明顯差異(P>0.05)；而與東莨菪堿組和暴露組相比，營參合劑組大鼠血清丙酮酸和β-羥基丁酸水平均明顯降低(P<0.05)。由此表明，營參合劑可以減少加速度暴露大鼠血清致疲勞物質的產生。見表3。

表3 各組大鼠血清丙酮酸和β-羥基丁酸水平比較(μmol/ml，x±s，每組n=8)

注：與對照組比aP<0.05；與暴露組比bP<0.05；與東莨菪堿組比cP<0.05

2.5 各組大鼠的海馬、前額皮層、肝臟、肌肉組織中ATP水平比較

與對照組相比，暴露組大鼠的4種組織中ATP水平明顯下降(P<0.05)。加速度暴露刺激后，東莨菪堿的處理并未發揮作用；而營參合劑能有效地提高加速度暴露刺激后大鼠4種組織中ATP水平(P<0.05)。見表4。

表4 各組大鼠海馬、前額皮層、肝臟和肌肉組織中ATP水平比較(nmol/mg protein，x±s，每組n=8)

注：與對照組比aP<0.05；與暴露組比bP<0.05；與東莨菪堿組比cP<0.05。ATP為三磷酸腺苷

3 討論

嚴重暈動病者可喪失自理能力或作業能力[16]。迄今已研究得到的數十種暈動病防治藥物雖然可以不同程度地減輕暈動病惡心、嘔吐等癥狀，但對暈動病疲勞癥狀均無明顯療效，還存在嗜睡等不良反應，嚴重限制了其在航海、航空等作業領域的應用[17]。本研究結果再次證實，經典的抗暈動病藥物東莨菪堿可以緩解加速度暴露大鼠暈反應指數的升高幅度，但對加速度暴露引起的腦力和體力疲勞沒有明顯影響。因此，研制一種能夠抗疲勞且無嗜睡等不良反應的抗暈動病藥物十分必要。

暈動病的發生與機體應激反應有關，而具有高基礎活性糖皮質激素系統的個體對異常加速度環境有較高的耐受能力[4]。另外，有研究者發現血糖的異常升高可刺激下丘腦嘔吐中樞引發嘔吐[6]。本研究組在動物實驗及人體試驗中先后發現，加速度暴露機體發生應激反應，血清胰島素水平下降、血糖升高，其在暈動病發生發展過程中起重要作用。有意義的是，本研究通過動物實驗初步證實，提前服用以具有增強皮質醇與其受體結合活性功效的中藥人參活性成分(Rb1、Rg1)和具有刺激胰島素分泌作用的營養素(葡萄糖、酪氨酸、亮氨酸)為主要成分的營參合劑不但可以一定程度地降低異常加速度暴露大鼠的暈反應指數，而且可以明顯緩解加速度暴露引起的腦力和體力疲勞。上述結果表明，營參合劑具有一定的暈動病預防功效，而且其作用環節與東莨菪堿的作用環節不同，因此可以緩解加速度暴露引起的腦力和體力疲勞，并沒有嗜睡等不良反應。

血清胰島素水平降低可以影響機體的能量代謝進而導致血清丙酮酸、β-羥基丁酸水平上升，而后者與疲勞的發生發展有關。本研究結果顯示，與暴露組大鼠相比，東莨菪堿組大鼠血清激素和血清丙酮酸、β-羥基丁酸等致疲勞物質水平沒有明顯變化；但營參合劑組大鼠血清皮質醇、腎上腺素和去甲腎上腺素水平明顯降低，血清胰島素水平明顯升高，血糖和血清丙酮酸、β-羥基丁酸水平均明顯降低。除此之外，研究發現營參合劑還能有效提高加速度暴露大鼠4種組織中ATP水平。這些結果提示，營參合劑預防暈動病作用可能與其能夠提高機體對異常加速度刺激的耐受能力，促進胰島素的分泌進而降低血清丙酮酸、β-羥基丁酸等致疲勞物質水平有關，確切的機制尚有待進一步研究。