基于網絡藥理學對沙利度胺治療原發性肝癌作用機制的研究

唐偉智，侯恩存，唐友明，鄭景輝，吳競，謝俊宇

在我國惡性腫瘤發病率中，原發性肝癌位列第三，僅次于肺癌和胃癌，其死亡率僅次于肺癌并逐漸上升［1-2］。原發性肝癌的非手術治療方式主要包括放化療、介入及生物靶向治療［3］。經過近年來的臨床使用發現，沙利度胺可通過抑制血管生成、調節免疫、誘導凋亡等方面的作用治療實體腫瘤［4］。沙利度胺在臨床使用單藥維持，聯合放、化療，及聯合肝動脈化療栓塞術（TACE）治療肝癌的研究中均有報道沙利度胺的有效性。一項回顧性分析結果顯示［5］，53例使用沙利度胺治療的晚期肝癌病人，6例緩解，疾病控制15例，中位生存期10.5月，1年生存率為45%，2年為20%，且沒有發生嚴重不良反應的病人。兩篇薈萃分析結果顯示TACE聯合沙利度胺治療肝癌的臨床療效優于單純TACE［6-7］。但沙利度胺治療肝癌的有效性仍存在爭議，一項病案報道發現，沙利度胺聯合賽庚啶治療肝細胞肝癌的病人在停用沙利度胺后的近一年時間內仍能維持肝腫瘤和肺轉移完全緩解［8］。Woo K等［9］一項實驗表明，沙利度胺不能用于抗肝癌治療，但它的衍生物因能誘導生長停滯、選擇性地誘導致瘤性肝祖細胞的凋亡而具有抗腫瘤藥物的潛力。故沙利度胺治療肝癌的療效及作用機制仍需進一步探索。

本研究起止時間為2018年6—12月，通過網絡藥理學及分子對接的角度研究沙利度胺治療原發性肝癌的可能作用機制。網絡藥理學基于“藥物-靶點-基因-疾病”原理的相互作用網絡，進行藥物對疾病網絡的干預和影響系統綜合的觀察［10］。分子對接則是通過計算機模擬配體置于受體的結合區域，即“鎖-鑰原理”，計算預測兩者間的結合親和性，進而闡明藥物作用機制［11］。

1 材料與方法

1.1 靶點的篩選 通過PubChem數據庫查詢沙利度胺的分子結構，保存為Smiles格式。Swiss Target Prediction數據庫可以根據二維和三維相似性度量與已知配體的組合，精確預測生物活性分子的目標［12］。將沙利度胺的分子Smiles結構導入該數據庫相關的靶點信息。通過CTD、GeneCards及Liverome數據庫收集與原發性肝癌（Liver Neoplasms）相關的靶點，篩選出三個數據庫共有的基因，與沙利度胺相關靶點相映射，獲得沙利度胺治療原發性肝癌的潛在作用靶點。并利用DisGeNET數據庫［13］分析靶點類型。

1.2 蛋白質相互作用網絡的構建 將沙利度胺的潛在作用靶點通過String數據庫［14］進行蛋白質-蛋白質相互作用分析，分析結果網絡關系圖使用Cytoscape 3.6.1軟件進行可視化，每一個節點（Node）對應一個蛋白靶點。使用軟件中插件Network Analyzer進行網絡特征分析，節點的度值（Degree）大小代表該蛋白在網絡中的重要性，根據Degree大小設置節點的顏色。

1.3 基因本體論（Gene Ontology，GO）分析DAVID在線生物數據分析工具可以提供來自基因組研究的大量基因的功能解釋，提供典型的基因術語富集分析［15］。將沙利度胺治療原發性肝癌的潛在作用靶點導入DAVID，研究物種限定為人類，GO分析內容選擇生物進程（BP）、細胞組成（CC）和分子功能（MF），這三個部分分析數據使用繪圖軟件Graphpad 7繪制成條形圖。

1.4 通路分析 京都基因和基因組百科全書（KEGG）是一個基因組序列和其他高通量數據的生物學解釋的綜合數據庫［16］，KEGGMapper是數據庫中用于KEGG映射的工具。將沙利度胺潛在作用靶點導入KEGGMapper中，通路分析結果通過Omicshare數據庫繪制成氣泡圖，“靶點-通路”網絡圖通過Cytoscape軟件構建。

1.5 分子對接 通過沙利度胺的結構分子與潛在作用靶點進行分子對接，驗證預測結果的可靠性。沙利度胺潛在作用靶點的PDB iD通過PDB（http：//www.rcsb.org/pdb/）查找。沙利度胺的分子結構通過Pubchem數據庫下載保存為Mol2格式，導入到系統對接網站（Systems Dock Web Site）進行在線分子與靶蛋白對接，預測其結合活性［17］?；贒ocK-IN評分，數值從0到10表示結合活性從弱到強，Score值＞7代表結合活性強烈，Score值＞5代表結合活性較好［15］。

2 結果

2.1 沙利度胺潛在作用靶點 將沙利度胺的Smiles格式導入Swiss Target Prediction，得到預測靶點15個。通過對CTD、GeneCards及Liverome數據庫進行檢索及整理，三個數據庫的共同肝癌靶點有5546個，與沙利度胺的預測靶點進行匹配，最后得到11個沙利度胺治療原發性肝癌的潛在靶點（PTGS2、DPP4、DPP9、P2RX7、PARP1、MBNL1、MBNL2、MBNL3、MMP2、MMP9、MMP1）。將11個靶點導入DisGeNET數據庫，結果表明沙利度胺作用于原發性肝癌過程中主要涉及各種酶（氧化還原酶、水解酶、轉移酶、連接酶）。

2.2 蛋白質相互作用網絡分析 將沙利度胺11個潛在作用靶點通過String數據庫進行蛋白互作分析，通過Cytoscape軟件進行網絡圖可視化，見圖1。網絡中共有節點9個，邊10個，其中MBNL2、P2RX7不在該蛋白互作關系中。節點的顏色越深，代表該節點Degree值越大。網絡中degree值較大的靶蛋白為PTGS2、MMP9（degree值＝4），表示這些蛋白在蛋白互作網絡中較為重要，見表1。

圖1 沙利度胺的蛋白質相互作用網絡

2.3 潛在作用靶點GO分析 圖2為沙利度胺治療原發性肝癌潛在靶點的GO分析結果，生物進程主要為蛋白質水解（5個靶點）。細胞組成主要為細胞核（7個靶點）、細胞外基質（3個靶點）。分子功能主要為絲氨酸型肽鏈內切酶活性、相同蛋白結合、多聚腺嘌呤核糖核苷酸結合及鋅離子結合（均為4個靶點）等。

表1 沙利度胺治療原發性肝癌潛在作用靶點信息

圖2 沙利度胺治療原發性肝癌潛在靶點的GO富集分析：A為生物進程；B為細胞組成；C為分子功能（個）

2.4 潛在作用靶點代謝通路分析 基于KEGG通路分析，結果顯示11個沙利度胺治療原發性肝癌潛在作用靶點參與了41條通路，將富集程度（Rich Factor）前20的通路（P＜0.05）繪制成氣泡圖，其主要富集于癌癥通路（Pathways in cancer）、核因子κB信號通路（NF-kappa Bsignaling pathway）、腫瘤壞死因子信號通路（TNF signaling pathway）及血管內皮生長因子信號通路（VEGF signaling pathway）等通路。4條信號通路涉及4個靶點，分別為MMP1、MMP9、MMP2及PTGS2。表明沙利度胺治療原發性肝癌的潛在靶點分布于不同通路協調發揮作用。其“靶點-通路”網絡圖中，PTGS2、MMP-9的度值較大（Degree值分別為20、14），表明沙利度胺主要通過PTGS2、MMP-9作用于各種通路。

2.5 分子對接分析 將沙利度胺與11個靶蛋白進行分子對接，結果顯示，沙利度胺分子與除MBNL2外的10個靶蛋白有良好的相互作用，見表2。結果表明了預測靶點的可靠性。

表2 沙利度胺與靶點的分子對接得分

3 討論

本研究通過預測沙利度胺的相關靶點，整合CTD、GeneCards及Liverome數據庫中的原發性肝癌相關靶點，最后獲取沙利度胺治療原發性肝癌的11個潛在作用靶點，主要由氧化還原酶、水解酶、轉移酶、連接酶等各種酶參與。其中，COX-2（PTGS2）在肝細胞中的高表達可通過減少TET1，沉默腫瘤抑制基因和激活關鍵的致癌途徑誘導啟動子甲基化來誘導肝細胞肝癌的發生［18］。而沙利度胺具有良好的環氧化酶抑制活性［19］。有研究報道［20］，沙利度胺可抑制 metalloproteinase-9（MMP-9）的活性，抑制MMP-9有助于褪黑素預防HepG2肝癌細胞的運動和侵襲性［21］。沙利度胺亦可抑制MMP-1和MMP-2的活性［20-22］。

通過GO分析，結果顯示沙利度胺的潛在作用靶點主要涉及生物進程的蛋白質水解及分子功能的絲氨酸型肽鏈內切酶活性、相同蛋白結合、多聚腺嘌呤核糖核苷酸結合和鋅離子結合。這些生物過程與維持細胞正常的生理功能相關［23-24］，表明沙利度胺可參與調節多種生物過程治療原發性肝癌。

基于KEGG通路分析，沙利度胺潛在靶點的代謝通路主要富集于癌癥通路、核因子κB信號通路、腫瘤壞死因子信號通路及血管內皮生長因子信號通路等通路。NF-κB是一種可以參與炎癥、細胞增殖和凋亡的轉錄因子［25］，研究表明［26］，NK-κB在肝癌肝內血管侵犯轉移相關。TNF-α是一種多效性炎性細胞因子，炎癥誘導的細胞毒性CD8+T淋巴細胞活化抑制作為腫瘤發展的重要機制，超過90%的肝細胞肝癌在肝損傷和炎癥的情況下出現［27-28］。TNF-α的陽性表達亦對肝癌的發生發展起促進作用［26］。推測沙利度胺通過抑制NF-κB通路及其對TNF-α表達的誘導發揮治療肝癌的作用，該作用與文獻報道相符［29］。

癌癥的主要標志之一是誘導血管生成，新生血管的生長可向惡性細胞提供充足的氧氣和營養，而血管內皮生長因子（VEGF）是胚胎、成人生理和病理過程中血管生成的主要驅動因子［30］。在腫瘤的持續生長過程中，腫瘤內部發生缺氧使VEGF的表達增加，促進腫瘤邊緣部位形成新的血管［31］。研究表明［32-33］，沙利度胺可顯著減少人血清中VEGF的水平。推測沙利度胺在VEGF信號通路中通過抑制VEGF表達發揮抗血管生成從而治療原發性肝癌的作用。沙利度胺抗血管生成作用與文獻報道相符［34］。

沙利度胺通過調控多通路協調發揮治療原發性肝癌的效果，文獻報道與本研究相關通路分析相符，因此預測的結果具有一定的可靠性。沙利度胺治療原發性肝癌的通過作用于11個潛在作用靶點，參與調控多條通路，表明了沙利度胺可通過多靶點、多通路途徑治療原發性肝癌的特點。