菊粉對高脂高糖飲食誘導肥胖小鼠的減肥作用與其調節腸道菌群的關系分析

王晨，朝浩鵬，謝宇端

隨著生活習慣和飲食結構的變化，全球范圍內肥胖的發生率逐年遞增，且兒童青少年人群中肥胖率也愈來愈高，主要是機體過量攝取能量引起的［1-2］。據報道，肥胖是糖尿病、冠心病等多種疾病的高危風險因素［3-5］，因而，肥胖及相關疾病受到廣泛關注。菊粉是一種鏈狀果聚糖，廣泛分布于菊芋、韭菜、洋蔥等植物中，可作為功能性食品基料［6］；菊粉一般聚合度在2～60之間，研究發現，不同聚合度的菊粉可對腸道菌群產生不同的益生效果［7］；另外，Weitkunat K等［8］報道高脂飼料中添加菊粉，可緩解肥胖。本研究于2017年2月至2019年4月，比較不同聚合度菊粉對高脂高糖飲食誘導肥胖小鼠的減肥作用及腸道菌群的調節作用，旨在為菊粉相關保健品的開發提供科學的指導。

1 材料與方法

1.1 動物 8周齡C57BL/6J小鼠購自上海冠導生物工程有限公司，動物生產許可證編號：SCXK（滬）2019-0005，小鼠體質量范圍為26～32 g，均為雄性，飼養于SPF級動物房中適應1周，自由攝食進水，相關操作均符合動物醫學倫理相關規定。

1.2 主要試劑與儀器 標準菊粉、短鏈菊粉購自山西寶瑞生物科技有限公司，普通飼料、高糖高脂飼料購自北京博泰宏達生物技術有限公司，高通量測序由上海瑞鹿生物技術有限公司檢測，蛋白一抗購自美國Abcam公司。血液生化儀購自南京普朗醫用設備有限公司，全自動凝膠成像儀購自美國Thermo Fisher公司。

1.3 分組與干預 將32只C57BL/6J小鼠以隨機數字表法分為四組，每組8只，分別為對照組、模型組、標準菊粉組和短鏈菊粉組；對照組喂食普通飼料，模型組喂食高脂高糖飼料，標準菊粉組和短鏈菊粉組小鼠分別喂食添加有5%標準菊粉、5%短鏈菊粉的高脂高糖飼料，共喂食8周，每周記錄小鼠體質量。

1.4 HE染色 干預結束后，每組隨機選3只取肝組織作病理切片，操作如下：腹腔注射5%水合氯醛麻醉小鼠，開胸暴露心臟，防凝血處理后，注入生理鹽水沖洗血管，再注入4%多聚甲醛灌注固定，當小鼠肝臟發白、鼓起提示灌注完成；1 h后取肝臟組織再次置于4%多聚甲醛中固定，經脫水透明后浸蠟包埋，切片至4～6μm，進行常規蘇木素-伊紅染色，封片后顯微鏡下觀察小鼠肝臟組織病理變化。

1.5 血清血脂的檢測 干預結束后，剩余小鼠剪尾取血，2 000 rpm/min離心10 min，分離上層血清，采用血液生化儀檢測小鼠血清中總膽固醇（Total cholesterol，TC）、三酰甘油（Triglycerides，TG）、高密度脂蛋白膽固醇（High density lipoprotein cholesterol，HDL-C）及低密度脂蛋白膽固醇（Low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）的含量。

1.6 蛋白質印跡法檢測 干預結束后，取血后采用頸部脫臼法處死小鼠，迅速解剖取出肝臟組織；加入RIPA裂解液勻漿，提取肝臟蛋白；檢測蛋白濃度后，取等量蛋白進行凝膠電泳，分離目的蛋白；采用“三明治”法，將蛋白條帶轉移至PVDF膜上；取出PVDF膜浸于5%脫脂奶粉液，室溫下封閉2 h；取出PVDF膜置于相應蛋白一抗，4℃孵育過夜；取出PVDF膜置于相應二抗，37℃孵育1 h；滴加ECL發光液，應用全自動凝膠成像儀進行化學發光。以βactin為內參，計算固醇調節元件結合蛋白-1c（Sterol regulatory element binding protein，SREBP-1c）、過氧化物酶體增殖物激活受體-γ（Peroxidosome proliferator-activated receptor-γ，PPAR-γ）的相對表達量。

1.7 高通量測序 干預結束后，收集小鼠新鮮糞便約150mg，參照QIAamp DNA stool mini kit試劑盒說明書，提取小鼠糞便中菌群總DNA；選擇16SrRNA的V3和V4區進行PCR擴增，得到的產物經瓊脂糖凝膠電泳純化，定量后構建Illumina MiSeq文庫，上機測序；最后進行生物信息學分析，根據OTUs（Operational taxonomic units）分析小鼠糞便中菌群的多樣性和不同微生物的豐度。本研究將重點關注肥胖相關菌群的變化，如：門水平［擬桿菌門、厚壁菌門］，科水平［乳酸桿菌、瘤胃菌］，嗜粘蛋白-艾克曼菌等。

1.8 統計學方法 采取統計學軟件SPSS21.0分析數據，計量資料均服從正態分布，以±s表示，比較選擇單因素方差分析、SNK-q檢驗，以P＜0.05表示組間差異有統計學意義。

2 結果

2.1 菊粉對肥胖小鼠體質量的影響 如圖1，小鼠體質量在26～30 g之間波動。與對照組相比，其他組別小鼠體質量均增加；與模型組相比，標準菊粉組和短鏈菊粉組小鼠體質量均有所下降，且短鏈菊粉組體質量下降程度更高。

圖1 菊粉對肥胖小鼠體質量的影響

2.2 菊粉對肥胖小鼠肝組織病理變化的影響 如圖2，對照組小鼠肝組織細胞排列整齊、規律，細胞間隙均勻，細胞核大而圓；模型組出現大量空泡樣病變，細胞核受擠壓縮??；標準菊粉組和短鏈菊粉組空泡樣程度較模型組明顯減輕，且短鏈菊粉組改善作用更好。

圖2 菊粉對肥胖小鼠肝組織病理變化的影響（HE染色×200）：A為對照組；B為模型組標，C為準菊粉,D為短鏈菊粉組

2.3 菊粉對肥胖小鼠血清血脂指標的影響 與對照組相比，模型組小鼠血清TC、TG及LDL-C水平顯著上升，HDL-C水平顯著下降（P＜0.05）；與模型組相比，標準菊粉組和短鏈菊粉組TC、TG及LDL-C水平顯著下降，HDL-C水平顯著上升（P＜0.05），短鏈菊粉組改善效果更好，見表1。

表1菊粉對肥胖小鼠血清血脂指標的影響/（μmpl/L，±s）

表1菊粉對肥胖小鼠血清血脂指標的影響/（μmpl/L，±s）

注：與對照組相比，a P＜0.05；與模型組相比，b P＜0.05

對照組模型組標準菊粉組短鏈菊粉組F值P值1.32±0.16 2.28±0.32a 1.96±0.27b 1.75±0.23b 20.420 0.000 8 8 8 8 2.41±0.25 4.19±0.53a 3.73±0.48b 3.26±0.43b 24.360 0.000 0.35±0.08 1.75±0.22a 1.36±0.17b 0.83±0.14b 115.906 0.000 6.85±0.78 4.74±0.55a 5.94±0.61b 6.08±0.67b 14.055 0.000

2.4 菊粉對肥胖小鼠肝組織脂代謝基因的影響如圖3、表2，與對照組相比，模型組小鼠肝組織中SREBP-1c的表達顯著上調，PPAR-γ的表達顯著下調（P＜0.05）；與模型組相比，標準菊粉組和短鏈菊粉組SREBP-1c的表達顯著下調，PPAR-γ的表達顯著上調（P＜0.05），且短鏈菊粉組作用效果更明顯。

圖3 各組小鼠肝組織脂代謝基因的表達：1為對照組，2為模型組，3為標準菊粉組，4為短鏈菊粉組

表2 菊粉對肥胖小鼠肝組織脂代謝基因的影響/±s

表2 菊粉對肥胖小鼠肝組織脂代謝基因的影響/±s

注：與對照組相比，a P＜0.05；與模型組相比，b P＜0.05

組別對照組模型組標準菊粉組短鏈菊粉組F值P值PPAR-γ 1.00±0.06 0.23±0.04a 0.47±0.09b 0.61±0.08b 168.866 0.000鼠數8 8 8 8 SREBP-1c 1.00±0.08 2.23±0.21a 1.78±0.18b 1.47±0.15b 81.427 0.000

2.5 菊粉對肥胖小鼠腸道菌群的影響 通過高通量測序發現，擬桿菌門和厚壁菌門是小鼠腸道中的兩大主導菌種，與對照組相比，模型組擬桿菌門/厚壁菌門顯著降低（P＜0.05）；與模型組相比，標準菊粉組和短鏈菊粉組擬桿菌門/厚壁菌門顯著上升（P＞0.05）?？扑缴?，模型組乳酸桿菌、瘤胃菌占比較對照組顯著下降（P＜0.05），而標準菊粉組和短鏈菊粉組乳酸桿菌、瘤胃菌占比較模型組顯著上升（P＜0.05）。與對照組相比，模型組嗜粘蛋白-艾克曼菌比例明顯下降（P＜0.05），干預標準菊粉和短鏈菊粉后，嗜粘蛋白-艾克曼菌比例明顯升高（P＜0.05），詳見表3。

表3 菊粉對肥胖小鼠腸道菌群的影響/±s

表3 菊粉對肥胖小鼠腸道菌群的影響/±s

注：與對照組相比，a P＜0.05；與模型組相比，b P＜0.05

對照組模型組標準菊粉組短鏈菊粉組F值P值0.84±0.12 0.09±0.02a 0.37±0.07b 0.48±0.14b 78.412 0.000 8 8 8 8 2.16±0.52 1.37±0.12a 1.78±0.18b 1.91±0.15b 10.265 0.000 1.28±0.11 0.13±0.03a 0.42±0.07b 0.94±0.09b 327.005 0.000 7.81±0.21 3.34±0.15a 4.23±0.17b 5.19±0.20b 881.631 0.000

3 討論

能量的攝取和消耗處于動態平衡時有助于機體維持正常體質量，當機體能量攝取量大于消耗量時，體內多余的能量將以脂肪的形式儲藏，過多的脂肪堆積將引起肥胖［9］。本研究應用高糖高脂飼料誘導肥胖小鼠，8周后小鼠體質量明顯高于喂食普通飼料小鼠，提示肥胖小鼠模型構建成功。而菊粉干預后小鼠體質量明顯減輕，且短鏈菊粉組減重更為明顯，提示菊粉具有減肥作用，與于秋紅等［10］研究結果相符?？赡苁蔷辗蹮o法被機體吸收，進入腸道后與脂肪、蛋白質等結合，減少能量物質的代謝；另外，菊粉還可增加消化道食糜黏度，阻礙機體吸收，最終隨糞便排出［11］。

肝臟是哺乳動物體內重要的代謝器官，在維持糖類、脂質和蛋白質等代謝平衡有重要作用，因此，肥胖在肝臟組織中會表現為脂肪樣病變，甚至影響肝臟功能［12］。本研究病理組織切片觀察到肥胖小鼠肝臟組織中有大量空泡樣變，而菊粉可明顯減輕肝臟損傷。同時發現，菊粉可減少肥胖小鼠TC、TG及LDL-C水平，并增加HDL-C水平。SREBP-1c是脂質代謝中重要的轉錄調控因子，能夠直接激活脂質合成相關基因，促進脂肪酸、TC的合成［13］。PPAR-γ特異性表達于脂肪組織，參與脂肪細胞分化和脂代謝的調節，促進脂質的分解，其低表達與肥胖的發生密切相關［14］。本研究發現菊粉可下調肥胖小鼠肝組織中SREBP-1c的表達，并上調PPAR-γ的表達。上述結果均提示，菊粉可減少肝組織脂質堆積，緩解血脂代謝異常，從而緩解肥胖，與Yu等［15］研究結果相似。

大量研究表明，腸道微生物對于肥胖有重要的調控作用，腸道菌群可直接參與宿主能量和物質代謝［16-17］。據報道，肥胖小鼠中擬桿菌豐度會下降，而厚壁菌比例會升高［18］，本研究也得出相似結果，且干預菊粉后，擬桿菌門/厚壁菌門明顯增加，接近于喂食普通飼料小鼠。乳酸桿菌是常見的益生菌之一，本研究顯示，菊粉干預后，小鼠腸道乳桿菌比例顯著增加。瘤胃菌是丁酸鹽產生菌，而丁酸鹽可維持腸道菌群結構穩定、保護腸道結構和功能［19］。本研究發現，菊粉可上調肥胖小鼠瘤胃菌比例。嗜粘蛋白-艾克曼菌是定植在腸道黏液層中的mucin降解菌，近年來研究發現，嗜粘蛋白-艾克曼菌可減少脂肪的堆積，改善血脂紊亂［20］；本研究結果顯示，菊粉可上調肥胖小鼠腸道嗜粘蛋白-艾克曼菌比例。上述結果表明，菊粉可與小鼠腸道菌群相互作用，增加益生菌比例，從而影響宿主能量和物質代謝水平，最終起到減肥的作用。另外，本研究還發現，短鏈菊粉作用效果優于標準菊粉，可能是聚合度更高，微生物發酵時間越長。

本研究比較了不同聚合度菊粉對高脂高糖飲食誘導肥胖小鼠的減肥作用及腸道菌群的調節作用，提示菊粉可有效緩解肥胖小鼠血脂紊亂，減少肝臟損傷和脂肪堆積，增加益生菌群占比，緩解小鼠肥胖，且短鏈菊粉效果更好，但其具體作用機制還需要深入分析與完善。