氯沙坦對急性肺損傷小鼠肺部組織及肺樹突狀細胞結構功能的作用

蘇華振，魏明

急性肺損傷（ALI）是一類較多見的危急重病，可能進展成為更加危急的急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）。病因眾多，其死亡率能夠達到40%［1-2］。當前研究認為其發病的主要因素為不可控制的炎性反應［3］。腎素-血管緊張素系統（RAS）的激活在ALI的發生發展中發揮重要的作用。RAS的主要效應因子血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）有顯著的促進炎癥發生的作用，它是介導ALI肺部炎性反應過程的關鍵因子［4-5］。作為血管緊張素Ⅱ的1型受體阻斷劑，氯沙坦能夠顯著降低肺部炎癥損傷水平［6］。樹突狀細胞（DC）能夠調節肺部免疫反應，并在其中發揮關鍵性作用。有研究表明，肺部組織感染以及由博來霉素誘發的肺部損傷過程都有肺DC的干預［7-8］。肺部結構RAS能夠調節肺DC的作用水平，AngⅡ可促進DC分化成熟［9］。但是氯沙坦能否依賴于抑制AngⅡ誘發的肺DC的激活從而緩解肺部組織炎性反應這仍有待于深究。此實驗應用脂多糖（LPS）來構建ALI小鼠的模型，研究在ALI中氯沙坦對肺DC的數目和功能的作用，從而深入探究氯沙坦對ALI產生的保護性機制。本研究符合動物倫理學要求。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 2016年10月至2018年12月于鄭州大學實驗動物中心購買72只C57BL/6小鼠，雄性，6～8周，體質量為18～22 g。許可證號：ZYXK（豫）2016-0289。在無特定病原體（SPF級）條件下常規喂養，標準化顆粒飼料、飲用水、墊料及其他相關物品都經滅菌處理。本研究符合動物倫理學要求。

1.2 試劑和器材 脂多糖（E.coli 0111：B4）購自Sigma公司，膠原酶V購自Sigma-Aldrich公司。小鼠CD11c、CD11b，組織相容性復合物（MHC Ⅱ），CD80及同型對照單克隆抗體都購自eBioscience公司。Losartan由Cayman公司提供。小鼠IL-6 ELISA kit購自上海依科賽生物有限公司。流式細胞儀購自美國BD公司（BDFACSCaliburTM）。

1.3 模型制備與分組 將72只SD小鼠按隨機數字表法分為健康對照組、ALI模型組和氯沙坦干預組，各24只。健康對照組：向小鼠腹腔中注射50μL的PBS，30 min后向氣管中滴加30 μL的PBS；ALI模型組［10-11］：向小鼠腹腔中注射50 μL的PBS，30 min之后向氣管中滴加2 mg/kg的脂多糖（溶于30μL PBS中）。成功構建脂多糖（LPS）-ALI模型的標準：肺部組織間質內充血、腫大，肺泡之間的間隙顯著增寬，肺部組織間質以及肺泡腔中有彌漫性炎癥細胞的包裹、出血，大部分肺泡結構萎縮［11］。氯沙坦干預組：向小鼠腹腔中注射15 mg/kg的氯沙坦（溶于50 μL PBS中），30 min之后構建脂多糖（LPS）-ALI模型。注射脂多糖或者PBS之后的6、12、24 h左右處死標本，留取待檢的肺組織。

1.4 標本的采集以及病理研究 于6、12、24 h采用右心室取血的方法處死小鼠（n＝6只小鼠/組/時間點）。將右肺部分組織（約0.5 cm×0.5 cm，1～2 g）進行甲醛固定、石蠟片包埋、再經切片、HE染色，由病理科一名醫師專門負責觀測其病理改變，并將組織小塊按照方法［12］對其進行損傷分級評分。規則如下：①肺泡的充血；②出血；③肺泡腔中或者血管壁上有中性粒細胞的包裹；④肺泡壁加厚和（或）有透明質膜的產生四項指標，分別按照病變的嚴重程度對其評0～4分（0分：沒有病理改變或極度輕微病變，1分：輕微病理改變，2分：中等程度病理改變，3分：嚴重病理改變，4分：極度重癥病理改變）。各部分的評分數之和即為急性肺損傷的總分數。

1.5 肺單細胞懸液制備 在滅菌的情況下拿出肺部組織30 mg，將其放于含有Hank′s平衡溶液的培養皿之中，把取到的肺部組織用眼科剪裁成1 mm×1 mm×1 mm大小的小塊，把裝有肺部組織小塊的培養皿放于培養箱中，勇膠原酶V溶液對其進行消化1 h（37℃，每隔3 min輕輕振搖數次），冰浴終止消化，緩緩吸打分離細胞，用200目的不銹鋼網格過篩，在EP管中集中收取消化液。再經1 000 r/min的速度離心10 min，去上清，于下層沉淀中注入2 mL的PBS緩緩吸打，相同的速度離心5 min，棄上清，于沉淀里加5 mL的紅細胞裂解液，緩緩吸打使細胞分散開來，冰塊上靜置10 min，相同的速度離心10 min，棄上清，加3 mL的PBS混合版均勻，離心5 min，速度同上。棄上清。用臺盼藍染液對細胞進行染色，細胞計數板涂片，光學顯微鏡下觀測活體細胞數目，之后將細胞的濃度調整到1×106/mL，冰凍保存備用。

1.6 肺濕重/體質量（LW/BW）檢測 取肺組織，把肺部組織表層多余的水分用吸水紙吸盡同時清理好血漬之后，稱量并算出肺組織LW/BW水平。

1.7 ELISA測定肺部組織IL-6水平 挑選右肺下部組織約10 mg，加入2 mL生理鹽水，用電動勻漿機制備肺組織勻漿，4℃，3 000 r/min離心10 min，留上清液，-80℃保存。按照試劑盒的說明書進行嚴格規范操作，450 nm處測吸光值，計算IL-6水平。

1.8 流式細胞儀測定肺部DC數目以及CD80、主要組織相容性復合物（MHC）Ⅱ的表達 在管中滴加0.5μg的抗CD16/CD32單克隆抗體避光反應10 min，在相對應的管中分別滴加0.25μg的抗CD11c-FITC單抗、0.125μg的CD11b-PE單抗、0.03μg的抗MHCⅡ-APC單抗以及0.06μg的抗CD80-APC單抗。并將FITC熒光標記的抗亞美尼亞倉鼠IgG、PE熒光標記的抗大鼠IgG2b、APC熒光標記的抗大鼠IgG2b設為同型的陰性對照管（抗體在使用之前應該緩慢搖勻），混合均勻，25℃避光反應20 min。1 200 r/min的速度離心5 min，棄去上層清液，向沉淀中滴加1 mL的含有1%BSA PBS混合均勻，同樣的速度離心5 min，棄去上層清液，滴加1%的多聚甲醛300μL，放于4℃避光存放，24 h之內上機檢測。檢測之前應該緩慢吸打，使細胞混合均勻，本研究重復3次。

1.9 統計學方法 計量資料以±s表示，采用SPSS 16.0統計軟件進行處理，行秩和檢驗、重復測量方差分析及LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 氯沙坦對小鼠肺部結構病理學變化產生的效果 6 h各組肺部結構切片進行HE染色，在光學顯微鏡下觀察。健康對照組中小鼠的肺泡間隙均等，肺泡腔中沒有明顯的滲出以及炎癥性包裹。ALI模型組小鼠的肺部組織病理學檢查可見其肺泡間隙顯著加寬、肺間質內血管有充血、出血同時彌漫的炎癥性包裹。氯沙坦干預組中小鼠肺部病理學檢查可見肺泡間隔稍稍加寬，產生少部分出血以及炎癥性包裹，與ALI模型組相比損傷大大降低。見圖1，2。

2.2 氯沙坦對小鼠肺LW/BW比的影響 6 h、12 h和24 h各組小鼠肺LW/BW比較，經方差分析，差異有統計學意義；與健康對照組相比，ALI模型組和氯沙坦干預組小鼠肺LW/BW升高（P＜0.05）；氯沙坦干預組肺LW/BW較ALI模型組降低（P＜0.05），見表1。

表1 氯沙坦對小鼠肺LW/BW比的影響/（%，±s）

表1 氯沙坦對小鼠肺LW/BW比的影響/（%，±s）

注：LW/BW為肺濕重/體質量，ALI為急性肺損傷；與健康對照組比較，a P＜0.05；與ALI模型組比較：b P＜0.05

24 h 0.50±0.03 0.67±0.05 a 0.58±0.06 ab 5.73 0.005組別健康對照組ALI模型組氯沙坦干預組F值P值鼠數24 24 24 6 h 0.49±0.03 0.71±0.04a 0.63±0.04ab 6.38 0.003 12 h 0.51±0.04 0.69±0.05a 0.61±0.03ab 5.96 0.005

2.3 氯沙坦對小鼠肺Smith損傷評分的影響 6 h、12 h和24 h，與健康對照組相比，ALI模型組和氯沙坦干預組小鼠肺組織病理切片評分增高（P＜0.05）；氯沙坦干預組肺損傷評分較ALI模型組明顯降低（P＜0.05）見表2。

表2 氯沙坦對小鼠肺Smith損傷評分的影響/（分，±s）

表2 氯沙坦對小鼠肺Smith損傷評分的影響/（分，±s）

注：ALI為急性肺損傷；與健康對照組比較，a P＜0.05；與ALI模型組比較，b P＜0.05

24 h 0.57±0.19 5.31±0.21 a 3.27±0.33 ab 121.38 0.003組別健康對照組ALI模型組氯沙坦干預組F值P值鼠數24 24 24 6 h 0.66±0.23 5.56±0.22a 3.98±0.21ab 127.24 0.003 12 h 0.61±0.20 5.49±0.19a 3.89±0.28ab 118.67 0.004

2.4 氯沙坦對小鼠肺組織勻漿IL-6水平的影響比較6 h、12 h和24 h各組小鼠肺組織勻漿IL-6含量，經方差分析，差異有統計學意義（F＝12.34、14.28和16.49，P＝0.004、0.003和0.002）。6 h、12 h和24 h ALI模型組小鼠肺組織勻漿中IL-6含量與健康對照組相比，差異有統計學意義（P＜0.05）；與ALI模型組比較，氯沙坦干預組IL-6含量降低（P＜0.05），見表3。

2.5 氯沙坦對小鼠肺組織DC數量的影響 6 h、12 h和24 h各組小鼠肺組織DC數量比較，經方差分析，差異有統計學意義（F＝17.64、14.21和12.76，P＝0.003、0.004和0.005）。與健康對照組比較，ALI模型組肺組織DC數量和氯沙坦干預組肺組織DC數量均顯著升高（P＜0.05）。ALI模型組與氯沙坦干預組肺組織DC數量差異無統計學意義（P＞0.05），見表4。

表3 氯沙坦對小鼠肺IL-6水平的影響/（pg/mg，±s）

表3 氯沙坦對小鼠肺IL-6水平的影響/（pg/mg，±s）

注：ALI為急性肺損傷；IL-6為白細胞介素-6；與健康對照組比較，a P＜0.05；與ALI模型組比較，b P＜0.05

24 h 355±108 3 018±264a 1 786±153ab 16.49 0.002組別健康對照組ALI模型組氯沙坦干預組F值P值鼠數24 24 24 6 h 396±96 2 864±185a 2 135±193ab 12.34 0.004 12 h 341±72 3 568±369a 2 539±238ab 14.28 0.003

表4 氯沙坦對小鼠肺樹突狀細胞數量的影響/（%，±s）

表4 氯沙坦對小鼠肺樹突狀細胞數量的影響/（%，±s）

注：ALI為急性肺損傷；與健康對照組比較，a P＜0.05；與ALI模型組比較，b P＞0.05

24 h 1.11±0.35 3.48±0.45a 3.29±0.33ab 12.76 0.005組別健康對照組ALI模型組氯沙坦干預組F值P值鼠數24 24 24 6 h 1.14±0.22 3.18±0.43a 2.96±0.37ab 17.64 0.003 12 h 1.09±0.31 3.34±0.37a 3.15±0.33ab 14.21 0.004

2.6 氯沙坦對小鼠肺部組織DC表達CD80的作用 6 h、12 h和24 h各組小鼠肺組織DC表達CD80比較，經方差分析，差異有統計學意義（F＝12.42、16.58和21.37，P＝0.006、0.004和0.002）。與健康對照組比較，ALI模型組和氯沙坦干預組肺DC表達CD80均升高（P＜0.05）。ALI模型組肺DC表達CD80明顯高于氯沙坦干預組（P＜0.05），見表5和圖3。

2.7 氯沙坦對小鼠肺組織DC表達MHCⅡ的影響 6 h、12 h和24 h各組小鼠肺組織DC表達MHCⅡ比較，經方差分析，差異有統計學意義（F＝1.45、1.68和1.35，P＝0.068、0.061和0.072）。與健康對照組比較，ALI模型組肺DC表達MHCⅡ和氯沙坦干預組肺DC表達MHCⅡ差異無統計學意義（P＞0.05），健康對照組和氯沙坦干預組肺DC表達MHCⅡ差異無統計學意義（P＞0.05），見表6和圖4。

表5 氯沙坦對小鼠肺樹突狀細胞功能狀態的影響/（%，±s）

表5 氯沙坦對小鼠肺樹突狀細胞功能狀態的影響/（%，±s）

注：ALI為急性肺損傷；與健康對照組比較，a P＜0.05；與ALI模型組比較，b P＜0.05

24 h 3.52±0.98 12.43±3.07a 9.24±3.01ab 21.37 0.002組別健康對照組ALI模型組氯沙坦干預組F值P值鼠數24 24 24 6 h 3.51±0.94 9.78±2.37a 7.41±2.64ab 12.42 0.006 12 h 3.56±1.02 10.56±2.69a 8.59±2.86ab 16.58 0.004

表6 氯沙坦對小鼠肺樹突狀細胞抗原提呈功能的影響/（%，±s）

表6 氯沙坦對小鼠肺樹突狀細胞抗原提呈功能的影響/（%，±s）

注：ALI為急性肺損傷；與健康對照組比較，a P＞0.05；與ALI模型組比較，b P＞0.05

24 h 82.33±17.52 80.27±18.16a 79.39±18.05ab 1.35 0.072組別健康對照組ALI模型組氯沙坦干預組F值P值鼠數24 24 24 6 h 81.31±16.94 78.24±18.23a 78.98±18.56ab 1.45 0.068 12 h 83.67±18.15 79.61±17.59a 80.14±18.34ab 1.68 0.061

3 討論

因為炎癥感染等多種原因使肺部多種炎性因子激活，從而使肺部組織的免疫反應失去控制是ALI發生的主要原因［13-14］。與此同時，缺少特異性藥物的治療成為影響其病情發展以及預后主要因素之一［15］。有研究［16］顯示，肺部RAS系統的活躍狀態在整個ALI的免疫紊亂中起到非常關鍵的作用。也有研究［6］顯示，氯沙坦可以顯著降低ALI肺部的炎性損傷，這揭示了其在ALI的臨床治療上可能具有重要的應用價值。而探究氯沙坦對ALI肺部免疫紊亂造成的炎性損傷機制有極其重大的意義。

本研究應用向氣管內注射脂多糖復制構建小鼠ALI模型，來重現由于肺部炎癥感染所致ALI的整個過程。本研究可見：ALI模型組小鼠肺LW/BW顯著升高，肺部切片能夠看到肺泡間隙加寬、肺部充血、出血以及彌漫性的炎性細胞的包裹，且IL-6水平也有顯著的增高，這都表明ALI模型復制成功［17］。本研究還可見到：與ALI模型組比較，經氯沙坦干預的小組LW/BW降低，肺部組織免疫損傷有所緩解，肺損傷的評分顯著降低，并且肺IL-6水平也明顯減低，提示氯沙坦能夠緩解肺部損傷。此外本研究還發現，與健康對照組相比，經氯沙坦干預組的小鼠肺部炎癥損傷水平依舊較高，提示氯沙坦對ALI產生部分保護的效果。

在肺部免疫系統的防御和保護中，肺DC都起到了非常重要的作用，其數目和功能與免疫效能的發揮有著相當密切的聯系［18］。目前已知的肺部感染，慢性阻塞性肺疾病以及支氣管哮喘等肺部炎性病變的產生與發展都有肺DC的參與［19］。本次實驗結果顯示，ALI小鼠的肺DC有廣泛積聚現象，其中其表達的CD80水平也顯著升高，這些均提示在ALI肺部炎性反應中，都有成熟的肺DC的身影。且在調節ALI肺部免疫損傷這一過程中，肺DC可能成為其重要靶點。健康對照組與ALI模型組小鼠肺DC表的達MHCⅡ分子水平都相對較高，并且沒有顯著差異，提示ALI小鼠肺DC的抗原遞呈能力沒有很大改變。機體內免疫反應的種類以及水平可能是由其DC的數目和功能來決定的。有研究［7］顯示，由博來霉素誘發的小鼠肺損傷模型中肺部成熟DC數目有明顯升高并且其同時還參與肺部免疫反應，阻礙肺DC的發育成熟能夠明顯緩解肺部的炎性損傷及其纖維化。

本研究證明：經氯沙坦干預小組對脂多糖（LPS）-ALI小鼠肺DC數目沒有太大影響，但是表達CD80的肺DC比例顯著降低，揭示了氯沙坦能夠通過阻礙肺DC成熟緩解ALI肺部免疫損傷水平。氯沙坦對ALI肺DC表達的MHCⅡ分子不產生顯著影響，提示了氯沙坦可能對DC的抗原遞呈功能沒有明顯影響。也有研究［9］發現，氯沙坦能夠顯著減輕實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠腦以及脊髓中的免疫損傷主要是依賴于對其組織中DC的激活和成熟的抑制。這也更加深入地說明了氯沙坦能夠通過阻礙DC成熟從而實現對ALI的免疫調節。

綜上所述，氯沙坦能夠通過抑制肺DC的發育成熟從而調節ALI肺部免疫損傷，在治療ALI的臨床手段上可能具有非常重要的應用價值。

（本文圖1～4見插圖4-1）

圖1 氯沙坦對6h小鼠肺組織病理變化的影響（HE×200）：1A為健康對照組，1B為急性肺損傷模型組，1C為氯沙坦干預組（箭頭所示為中性粒細胞）

圖2 急性肺損傷模型組6h肺部組織的標志性病理變化（HE×400）：2A為肺泡間隔增寬，其內可見大量炎癥細胞包裹，2B為血管壁和肺泡腔內中性粒細胞等炎性細胞大規模侵襲（箭頭所示為中性粒細胞），2C為肺泡腔中有出血，2D為肺部小血管充血、滲出

圖3 氯沙坦對6h小鼠肺組織CD80的影響：3A為健康對照組，3B為急性肺損傷模型組，3C為氯沙坦干預組

圖4 氯沙坦對6h小鼠肺組織主要組織相容性復合物（MHC）Ⅱ的影響：4A為健康對照組，4B為急性肺損傷模型組，4C為氯沙坦干預組