柴胡疏肝散調節大鼠額葉環磷酸腺苷/環磷酸腺苷反應元件結合蛋白/腦源性神經營養因子信號通路發揮抗抑郁作用研究

張付民，劉俊

近年來，隨著人們生活節奏的加快，抑郁癥發病率逐年上升，據世界衛生組織（WHO）統計，全球范圍內約有4.3%的人患有抑郁癥，而中國的抑郁癥發病率高達5%～6%，并且發病率呈逐年上升趨勢［1-3］。抑郁癥會對人們的生活和工作造成嚴重影響，據統計抑郁及焦慮障礙每年可導致超過一萬億美元的經濟損失，因此，抑郁癥已日益凸顯為社會和醫療問題［4-5］。但目前尚無治療抑郁癥的理想藥物，因此亟待解決。抑郁癥多屬于中醫“郁證”范圍，治療多以疏肝解郁為主。柴胡疏肝散出自《景岳全書》，為疏肝解郁的代表方劑，是現代臨床治療抑郁癥的經典方和有效方［6-7］?，F代藥理研究也證明柴胡疏肝散具有抗抑郁、調節神經-內分泌-免疫網絡、抗炎、抗氧化應激等藥理作用［8］。相關研究發現前額葉皮層（Prefrontal cortex，PFC）中環磷酸腺苷/環磷酸腺苷反應元件結合蛋白/腦源性神經營養因子（cAMP/CREB/BDNF）信號通路失調是引起抑郁癥發病的重要機制［9-10］。但柴胡疏肝散是否可以通過調節cAMP/CREB/BDNF信號通路進而發揮抗抑郁作用尚不明確?；诖?，本實驗通過慢性不可預知溫和應激（Chronic unpredictable mild stress，CUMS）建立抑郁癥模型，用Real time-PCR和蛋白質印跡法檢測cAMP/CREB/BDNF信號通中關鍵因子cAMP、CREB、BDNF的基因和蛋白的表達，以期為柴胡疏肝散改善抑郁癥提供實驗依據。本研究自2017年1月至2018年10月研究柴胡疏肝散對CUMS抑郁癥模型大鼠的抗抑郁作用及其作用機制是否與cAMP/CREB/BDNF信號通路有關。

1 材料

1.1 動物 SPF級雄性SD大鼠，40只，6～8周齡，體質量為200～220 g，由湖北省實驗動物研究中心提供，許可證號：SCXK（鄂）2015-0018。飼養于獨立通氣籠系統，濕度控制為40%～50%，溫度控制為24℃～26℃。

1.2 主要藥品及試劑 草酸艾司西酞普蘭片，生產批號2557798，西安楊森制藥有限公司；柴胡疏肝散由陳皮、柴胡各6 g，川芎、香附、枳殼、白芍各4.5 g，炙甘草1.5 g組成，飲片購自恩施州中心醫院中藥房。TRIzol Reagent，生產批號15596026，美國Thermo Scientific；ReverTra Ace qPCR RT Master Mix逆轉錄酶試劑盒，上?；偕锟萍加邢薰?，生產批號 FSQ-201；SYBR Premix Ex Taq［TM］，大連 Takara公司，生產批號 RR820A；一抗：cAMP、BDNF、CREB，均為兔多克隆抗體，生產批號分別為：sc-66843、sc-20981、sc-58，美國Santa Cruz公司。二抗，HRP標記山羊抗兔抗體（1∶3 000），武漢艾美捷科技有限公司，生產批號111-035-003。

1.3 主要儀器 Lumi Station 1800型多功能酶標儀（上海閃譜生物科技有限公司）、PPSQ-31A型核酸蛋白分析儀（德國島津科學儀器有限公司）、QuantStudio Dx型實時熒光定量PCR擴增儀（美國Life Technologies公司）、ChemiScope 6000 Exp型凝膠圖像成像分析系統（海勤翔科學儀器有限公司）。

2 方法

2.1 動物分組 適應性飼養1周后，采用SPSS19.0生成隨機數字表，將40只大鼠隨機分為空白組、模型組、艾司西酞普蘭組和柴胡疏肝散組，每組10只，除空白組外，其他各組采用CUMS制備抑郁癥大鼠模型?？瞻捉M大鼠以每籠5只飼養，其他各組大鼠采用單籠飼養。本研究獲得恩施州中心醫院實驗動物倫理委員會批準，并嚴格執行倫理委員會的要求。

2.2 抑郁癥模型的建立及給藥 參考文獻［11］制作抑郁癥模型：抑郁癥造模采用CUMS法，CUMS包括9種方法：冰水刺激（4℃）、熱水刺激（45℃）、足底電刺激（2 mA）、潮濕墊料（24 h）、禁食（24 h）、禁水（24 h）、睡眠剝奪（24 h）、水平震蕩、氨水刺激，上述9種刺激法隨機排列，相同刺激不可連續出現，連續刺激8周。第5～8周進行灌胃，持續給藥4周，艾司西酞普蘭組大鼠按10.0 mg·kg-1·d-1的劑量灌胃草酸艾司西酞普蘭片，柴胡疏肝散組按2.8 g·kg-1·d-1的劑量灌胃柴胡疏肝散藥液，空白組和模型組灌胃等體積的生理鹽水，1次/天。

2.3 指標檢測

2.3.1 蔗糖偏好實驗 實驗前先做適應性訓練，第1天，鼠籠上放置一瓶2%的蔗糖溶液和一瓶等體積的清水，禁食禁水24 h后，再次在鼠籠上放置一瓶2%的蔗糖溶液和一瓶等體積的清水，測試24 h，稱量并計算糖水偏好率。

2.3.2 強迫游泳實驗 自制上方開口的圓柱形玻璃容器（直徑50 cm，高60 cm），向容器注水至30 cm，將實驗大鼠置于容器中，記錄大鼠5 min內不動的總時間。

2.3.3 曠場實驗實驗 將實驗大鼠置于不透明鋼板制成（100 cm×100 cm×40 cm）的礦產箱內，打開攝像機拍攝，使用Smart virsion 2.5軟件記錄大鼠5 min內行為，記錄5 min內大鼠的活動路程、活動時間、休息時間、中央區域穿越格數及活動軌跡。

2.3.4 PFC區尼氏染色實驗 行為學檢測完畢后，選取部分大鼠進行PFC區尼氏染色：先用8%水合氯醛經腹腔注射麻醉（4 mL/kg），待麻醉好后，用4%多聚甲醛溶液經心臟灌注，端頭取腦，取PFC區，置4%多聚甲醛固定24 h，用尼氏染色觀察各組大鼠PFC區病理形態變化。

2.3.5 Realtime-PCR 檢測 PFC中 cAMP、BDNF、CREB mRNA的表達水平 取血后冰上剝離PFC，置液氮速凍后移至-80℃冰箱保存。用Trizol法提取PFC總mRNA，提取過程參考Trizol說明書；提取后用核酸蛋白儀檢測RNA純度，讀數為1.8～2.0表示提取合格；用ReverTra Ace qPCRRTMaster Mix逆轉錄酶試劑盒逆轉錄合成cDNA，合成過程參考說明書；用 SYBR Premix Ex Taq［TM］試劑進行 PCR 反應，置PCR儀進行基因擴增。用2-△△Ct表示mRNA相對表達水平。cAMP、CREB、BDNF及內參β-actin序列見表1。

表1 引物序列

2.3.6 蛋白質印跡法檢測PFC中cAMP、BDNF、CREB的蛋白表達水平 稱取PFC區腦組織20 mg，加入預冷的RIAP裂解液和PMSF，置4℃組織研磨機研磨，充分研磨后，置4℃離心機，以12 000 r/min離心20 min，取上清，用BCA蛋白質試劑盒檢測各樣本蛋白濃度；參考SDS-PAGE凝膠試劑盒說明書制作SDS-PAGE凝膠，依次加樣、電泳、轉膜；稀釋一抗，并按抗體說明書孵育一抗 cAMP（1∶1 000）、CREB（1∶2 000）和BDNF（1∶3 000），置4 ℃冰箱過夜，TBST洗膜3次，加入二抗（1∶3 000），再次用TBST洗膜3次，ECL顯色。最后置于凝膠圖像成像分析系統，曝光各組蛋白條帶，拍照，讀取灰度值，并進行統計分析。

2.4 統計學方法 采用統計軟件SPSS19.0處理，實驗數據以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，方差齊性時，多組間比較采用LSD法，P＜0.05差異有統計學意義，方差不齊時，多組間比較采用Dunnett’s T3法，P＜0.05差異有統計學意義。

3 結果

3.1 蔗糖偏好實驗和強迫游泳實驗結果 與空白組比較，模型組大鼠糖水偏好率顯著下降（P＝0.000），強迫游泳不動時間明顯增加（P＝0.000），均差異有統計學意義（P＜0.01）。與模型組比較，艾司西酞普蘭組大鼠糖水偏好率增加（P＝0.028），強迫游泳不動時間減少（P＝0.019），柴胡疏肝散組大鼠糖水偏好率也有所增加（P＝0.031），強迫游泳不動時間則有不同程度減少（P＝0.012），均差異有統計學意義，見表2。

表2 柴胡疏肝散對慢性不可預知溫和應激（CUMS）大鼠糖水偏好率和強迫游泳實驗的影響/±s

表2 柴胡疏肝散對慢性不可預知溫和應激（CUMS）大鼠糖水偏好率和強迫游泳實驗的影響/±s

注：與空白組比較，a P＜0.01；與模型組比較，b P＜0.05

組別空白組模型組艾司西酞普蘭組柴胡疏肝散組不動時間/s 35.25±13.23 64.39±10.62a 50.35±16.49b 47.93±18.71b只數10 10 10 10糖水偏好率/%86.42±14.55 60.75±15.63a 74.97±8.33b 77.39±18.39b

3.2 曠場實驗結果 與空白組比較，模型組大鼠運動距離和穿越中央區域次數顯著減少（均P＝0.000），靜止時間顯著增加（P＝0.000），均差異有統計學意義（P＜0.01）。與模型組比較，艾司西酞普蘭組大鼠運動距離和穿越中央區域次數增加（P＝0.000，P＝0.012），靜止時間減少（P＝0.000），柴胡疏肝散組大鼠運動距離和穿越中央區域次數增加（P＝0.000，P＝0.011），靜止時間減少（P＝0.028），均差異有統計學意義，見表3。

3.3 尼氏染色結果 空白組大鼠PFC區神經元數目豐富，細胞形態飽滿，結構完整，邊緣清晰，尼氏體呈淺藍色，多為虎斑狀或細顆粒狀，樹突明顯。模型組大鼠PFC區神經元數目減少，細胞形態不規則，排列稀疏，尼氏小體顏色較深，尼氏小體數目減少，部分尼氏體出現固縮和深染，樹突數目減少或消失。艾司西酞普蘭組和柴胡疏肝散組尼氏小體固縮和深染減輕，結構較完整、清晰，樹突減少情況好轉。

表3 柴胡疏肝散對慢性不可預知溫和應激（CUMS）大鼠在曠場試驗中自主活動的影響/±s

表3 柴胡疏肝散對慢性不可預知溫和應激（CUMS）大鼠在曠場試驗中自主活動的影響/±s

注：與空白組比較，a P＜0.01；與模型組比較，b P＜0.05，c P＜0.01

組別空白組模型組艾司西酞普蘭組柴胡疏肝散組靜止時間/s 51.58±15.18 83.55±13.87a 62.64±12.85c 66.75±16.15b例數10 10 10 10運動距離/cm 654.32±67.74 400.29±40.24a 535.99±47.61c 502.59±36.13c穿越中央區域次數19.34±3.51 11.56±4.92a 16.33±4.61b 15.68±3.56b

3.4 Real time-PCR檢測結果 與空白組比較，模型組大鼠PFC中cAMP、CREB、BDNFmRNA表達水平明顯降低，均差異有統計學意義（均P＝0.000）。與模型組比較，艾司西酞普蘭組大鼠PFC中cAMP、CREB、BDNF mRNA表達水平升高（均P＝0.000），柴胡疏肝散組大鼠PFC中cAMP、CREB、BDNF mRNA表達水平亦有升高（P＝0.024，P＝0.000，P＝0.000），見表4。

表4 各組大鼠前額葉皮層中cAMP、CREB、BDNFmRNA表達水平/± s

表4 各組大鼠前額葉皮層中cAMP、CREB、BDNFmRNA表達水平/± s

注：cAMP為環磷酸腺苷，CREB為環磷酸腺苷反應元件結合蛋白，BDNF為腦源性神經營養因子；與空白組比較，a P＜0.01；與模型組比較，b P＜0.05，c P＜0.01

BDNFmRNA 0.79±0.16 0.40±0.13a 0.61±0.21c 0.64±0.26c組別空白組模型組艾司西酞普蘭組柴胡疏肝散組例數10 10 10 10 cAMPmRNA 0.81±0.28 0.37±0.16a 0.69±0.18c 0.53±0.16b CREBmRNA 0.95±0.22 0.43±0.18a 0.73±0.22c 0.79±0.15c

3.5 蛋白質印跡法檢測結果 與空白組比較，模型組大鼠 PFC中 cAMP、CREB、BDNF蛋白（0.28±0.13）、（0.41±0.15）、（0.43±0.11）表達水平明顯降低，均差異有統計學意義（均P＝0.000）。與模型組比較，艾司西酞普蘭組大鼠PFC中cAMP、CREB、BDNF蛋白（0.44±0.11）、（0.55±0.14）、（0.63±0.21）表達水平升高（P＝0.000，P＝0.023，P＝0.000），柴胡疏肝散組大鼠PFC中cAMP、CREB、BDNF蛋白（0.47±0.27）、（0.59±0.11）、（0.58±0.15）表達水平亦有升高（P＝0.000，P＝0.011），均差異有統計學意義，見表5和圖1。

圖1 各組大鼠前額葉皮層（PFC）中cAMP、CREB、BDNF的蛋白條帶：A為空白組，B為模型組，C為艾司西酞普蘭組，D為柴胡疏肝散組

表5 各組大鼠前額葉皮層中cAMP、CREB、BDNF的灰度值分析/± s

表5 各組大鼠前額葉皮層中cAMP、CREB、BDNF的灰度值分析/± s

注：cAMP為環磷酸腺苷，CREB為環磷酸腺苷反應元件結合蛋白，BDNF為腦源性神經營養因子；與空白組比較，a P＜0.01；與模型組比較，b P＜0.05，c P＜0.01

BDNF 0.71±0.13 0.43±0.11a 0.63±0.21c 0.58±0.15b組別空白組模型組艾司西酞普蘭組柴胡疏肝散組N 10 10 10 10 cAMP 0.62±0.11 0.28±0.13a 0.44±0.11c 0.47±0.27c CREB 0.65±0.17 0.41±0.15a 0.55±0.14b 0.59±0.11b

4 討論

抑郁癥是以顯著而持久的心境低落為主要臨床特征的精神類疾病，其癥狀與中醫的“郁證”“百合病”“臟躁”“梅核氣”等病證相近［12］。中醫學認為其病位主要在肝，肝氣郁結為其基本病機，治療當以疏肝解郁為主［13］。柴胡疏肝散為疏肝解郁的代表方劑，出自《景岳全書》。方中柴胡疏肝解郁，為君藥。香附疏肝理氣止痛，川芎行氣活血止痛，為臣藥。陳皮、枳殼理氣行滯，芍藥養血柔肝緩急止痛，為佐藥。甘草調和諸藥，為使藥［14］。近年來，學者多從調節腦內單胺類神經遞質的含量和腦源性神經營養因子表達水平等方面來研究柴胡疏肝散的抗抑郁作用［15-17］，但學者對其神經可塑性、神經再生和細胞信號通路等方面的研究較少，基于此，本研究將神經可塑性作為研究柴胡疏肝散抗抑郁作用的研究對象。

快感缺失是抑郁癥病人的核心行為表現，因此抑郁癥動物模型是否存在快感缺失就成為評價抑郁癥造模成功與否的重要評價指標［18］。本研究采用經典的CUMS法誘導建立抑郁癥模型，通過應用蔗糖偏好實驗、強迫游泳實驗和曠場實驗等經典動物抑郁樣狀態評價方法，我們發現模型組大鼠糖水偏好率、運動距離和穿越中央區域次數顯著減少（P＜0.01），強迫游泳不動時間和靜止時間顯著增加（P＜0.01），這說明本實驗成功通過CUMS誘導建立了抑郁癥大鼠模型。給予模型大鼠柴胡疏肝散組后，大鼠糖水偏好率、運動距離和穿越中央區域次數均有所增加（P＜0.01，P＜0.05），強迫游泳不動時間和靜止時間均有所減少（P＜0.01，P＜0.05），這說明柴胡疏肝散具有抗抑郁的作用。

大腦是人體控制情緒的核心部位，情緒的變化是大腦各個分區協同作用的結果。PFC是工作記憶和情緒控制的核心腦區［19］。腦的功能影像和腦刺激研究表明抑郁癥病人PFC區有明顯的病理性改變，這說了PFC與抑郁癥的密切關系［20-21］。本研究發現模型組大鼠PFC區神經元數目減少，細胞形態不規則，排列稀疏，尼氏小體顏色較深，尼氏小體數目減少，部分尼氏體出現固縮和深染，樹突數目減少或消失。而給予模型大鼠柴胡疏肝散后，大鼠尼氏小體固縮和深染減輕，結構較完整、清晰，樹突減少情況好轉，這說明柴胡疏肝散具有神經保護的作用。cAMP/CREB/BDNF信號通路是影響抑郁癥發病機制的重要信號轉導通路［22］。腺苷酸環化酶（AC）活化會催化三磷酸腺苷（ATP）生產cAMP，cAMP會激活促使蛋白激酶A（PKA）激活，PKA激活會使其下游靶標環磷腺苷反應元件結合蛋白（CREB）磷酸化，CREB磷酸化從而促進了BDNF的表達，最終發揮生物學效應［23-24］。本研究發現，模型組大鼠PFC中cAMP、CREB、BDNF的基因和蛋白表達水平降低（P＜0.01，P＜0.05），這說明應激可以抑制cAMP/CREB/BDNF信號通路的表達，而給予模型大鼠柴胡疏肝散后，大鼠PFC中cAMP、CREB、BDNF的基因和蛋白表達升高（P＜0.01，P＜0.05），這說明柴胡疏肝散可以上調cAMP/CREB/BDNF信號通路

綜合上述分析，柴胡疏肝散具有抗抑郁的作用，并有保護神經的作用，其機制可能與其上調cAMP/CREB/BDNF信號通路有關。

中藥抗抑郁具有療效確切、服用方便、毒副作用小等優點，但我國對中藥抗抑郁的機制研究仍不夠細致深入，因此本研究也為中藥抗抑郁的研究提供了一定的經驗［25］。