腎氣丸對缺血再灌注損傷小鼠腎細胞凋亡的作用及機制研究

趙峰，綦海燕，肖程程，蔣楠，吳帥

急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）是一種常見且危重的臨床疾病，發生在約5%的住院病人中，總死亡率在45%～70%之間［1-3］。而腎缺血再灌注（ischemiareperfusion，I/R）損傷是急性腎損傷的主要病因之一，常發生于腎移植、腎動脈栓塞及休克病人［4-6］。研究表明，細胞內活性氧（reactive oxygen species，ROS）、促炎性細胞因子和促凋亡因子在腎I/R損傷中起重要作用［7-8］。腎氣丸出自《金匱要略》，具有溫補腎陽的功效。研究表明腎氣丸具有抗生精細胞、肝細胞凋亡的作用［9-10］，但其對腎臟I/R損傷的保護作用及機制尚不明確。本研究于2018年4—7月研究腎氣丸在小鼠I/R誘導的急性腎損傷中的保護作用及機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 8周齡健康雄性C57BL6小鼠40例，清潔級，體質量20～25 g，購于北京華阜康生物科技股份有限公司。過程中對動物的處置嚴格遵守2006年科學技術部發布的《關于善待實驗動物的指導性意見》。

1.1.2 藥品與試劑 腎氣丸中所含中藥飲片均一次性購于青島市中醫醫院門診中藥局。制備：中藥浸泡2 h，第1煎200 mL，30 min，取汁；第2煎200 mL，20 min，取汁；第3煎200 mL，20 min，取汁。將3次所煎取的藥液混合，濃縮至100%濃度，即1 g/mL。血清肌酐（SCr）、尿素氮（BUN）測試盒，購自上海微蒙生物科技有限公司；丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒均購自南京建成生物制品公司；β-actin，Bcl-2和Caspase-3購自艾博抗上海貿易有限公司。磷脂酰肌醇3-激酶（P13K）、蛋白質絲氨酸蘇氨酸激酶信號通路（AKT）抗體購自Cell signaling tecnology公司，二抗購自Santacrus公司。

1.2 分組與模型建立

1.2.1 分組 將小鼠在20℃～26℃實驗室喂養2 d，利用隨機數字表法分為4組，每組10例：①假手術組；②腎缺血再灌注組（腎I/R組）；③腎氣丸低劑量組；④腎氣丸高劑量組。腎氣丸低劑量組和高劑量組均給予腎氣丸中藥液灌胃，每天劑量分別為10.5 g/kg和21.0 g/kg，治療持續2周［11］。假手術組和腎I/R組使用生理鹽水進行灌胃，2周后構建腎I/R損傷的小鼠模型。

1.2.2 模型建立 本次實驗構建腎I/R損傷模型，10%水合氯醛腹腔麻醉，剖腹手術，游離雙側腎蒂。腎I/R組和腎氣丸組（低劑量組和高劑量組）小鼠夾閉雙側腎蒂，夾閉時間為30 min，之后摘掉動脈夾以恢復腎組織血流的灌注，再對小鼠腹壁進行縫合［12-14］。假手術組開腹并游離雙側腎蒂但不夾閉血管，其余操作相同。腎組織血流再灌注24 h后，對各組小鼠進行腹主動脈采血，分離并提取血清，各組標本分別保存在冰箱中，待檢測血清Scr、BUN含量。然后摘取左腎，仔細剪除附著的脂肪組織和筋膜，一部分迅速置于-80℃冰箱中保存，另一部分固定液經固定后，常規石蠟包埋。

1.3 檢測方法

1.3.1 腎組織勻漿制備 制備勻漿前除去組織血液，用濾紙吸干，準確稱重。將干凈、干燥的勻漿管置于冰水混合物中，把組織塊放于勻漿管中，做到盡快剪碎組織，然后按1∶9（W/V）加入冰生理鹽水，進行組織勻漿。而后將勻漿移入干燥試管，置于4℃離心機中，以3 000 r/min的速度離心10 min。取上清液儲存待測。

1.3.2 生化檢查 Scr、BUN、MDA含量及SOD活性檢測，以上指標均按照相應試劑盒說明書進行檢測。

1.3.3 HE染色 取稱量后的左側腎組織，于4%的多聚甲醛溶液中固定72 h后經石蠟包埋、切片（厚度為5μm）、脫蠟水化處理后行常規蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin staining，HE）染色，使用倒置光學顯微鏡對各組小鼠腎組織的病理形態進行觀察并評估損傷程度。

1.3.4 TUNEL染色 石蠟組織切片經脫蠟水化處理后，修復抗原37℃與Proteinase K作用，封閉非特異性反應加上胎牛血清和小牛血清白蛋白，用PBS漂洗，加入TUNEL緩沖液，PBS漂洗，給予3%甲醇溶液對內源性過氧化物酶進行阻斷，PBS漂洗，再次封閉非特異性抗原加入羊血清，使用PBS進行漂洗，加1∶2稀釋的POD，PBS進行漂洗，使用DAB顯色及蘇木精襯染，采用光學顯微鏡觀察標本，細胞核黃染為陽性著色

1.3.5 PCR及免疫組化檢測Bcl-2、Caspase-3表達水平 RNA提取試劑盒提取組織總RNA，各組取等量RNA進行反轉錄，通過PCR擴增Bcl-2、Caspase-3及內參β-actin的cDNA。每個檢測點設3個平行反應管，以cDNA為模板對Bcl-2、Caspase-3基因進行定量PCR擴增。引物序列如下：Bcl-2，正向5′-GCCATATGGCGCACGCTGGGAGAA-3′，反向 5′-GCGCTCGAGTCACTTGTGGCCCAGATA-3′；Caspase-3，正向5′-TGGACCTGTTGACCTGAAA-3′，反向5′-ACAAAGCGACTGGATGAACC-3′；β-actin，正向5′-CTGAGAGGGAAATCGTGCGT-3′，反向5′CCACAGGATTCCATACCCAAGA-3′。根據各反應管的靶基因循環閾值（Ct）和內參基因Ct值，采用比較Ct值法（2-ΔΔCt）計算E-Bcl-2、Caspase-3水平。

1.3.6 蛋白質印跡法檢測PI3K、AKT蛋白表達組織蛋白的提取 將標本儲存于-80℃低溫冰箱中，在蛋白提取前，先對標本進行稱重，每100 mg組織中加入1 mL RIPA，加入1 0μL PMSF，組織勻漿，低溫離心15 min，10 000～14 000 r/min，取上清加入5×蛋白上樣緩沖液，煮沸5 min分裝，-70℃保存，現用現取。將蛋白提取以后，進行灌膠上樣，加樣后先使用恒流（10 mA），再使用恒壓（100 V）電泳至溴酚藍到凝膠的底部。至電泳結束以后，把凝膠移到PVDF膜上，轉移使用100 V電壓，時間2 h。上述操作結束后，把PVDF膜轉移到平皿中，其內含有封閉液，在室溫條件下，于搖床上搖動封閉2 h。取出PVDF膜，加入稀釋后的一抗（1∶1 000）冰箱里4℃過夜。然后在室溫條件下，使用TBST脫色搖床上洗滌3次，每次時間10 min。然后加入1∶1 000比例稀釋的辣根酶標記羊抗兔IgG抗體，在室溫下進行孵育，時間1 h，再使用TBST脫色搖床上洗滌5次，每次時間10 min。其后在PVDF膜上滴加顯色劑，進行顯色照相。最后用quantity one軟件對條帶進行分析。

1.4 統計學方法 用SPSS23.0統計學軟件進行統計分析。計量資料采用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 腎氣丸對BUN和Scr含量的影響 與假手術組比較，腎I/R組腎功能受損明顯，BUN和Scr含量均增高，差異有統計學意義（P＜0.05）。與I/R組比較，腎氣丸組（低劑量組和高劑量組）BUN和Scr含量降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。與腎氣丸低劑量組比較，腎氣丸高劑量組中BUN和Scr含量降低，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 C57BL6小鼠Scr、BUN的比較/±s

表1 C57BL6小鼠Scr、BUN的比較/±s

注：BUN為尿素氮，Scr為血清肌酐。與假手術組比較，a P＜0.05；與腎I/R組比較，b P＜0.05；與腎氣丸低劑量組比較，c P＜0.05

Scr/（μmol/L）135.65±11.21 413.47±36.68a 308.32±17.36ab 225.59±21.05abc 253.192 0.000組別假手術組腎I/R組腎氣丸低劑量組腎氣丸高劑量組F值P值鼠數10 10 10 10 BUN/（mmol/L）8.37±1.80 67.45±8.40a 43.32±4.82ab 20.63±2.77abc 259.409 0.000

2.2 腎氣丸對MDA含量及SOD活性的影響 腎I/R組和腎氣丸組（低劑量組和高劑量組）中腎組織SOD活性均低于假手術組（P＜0.05），MDA含量高于假手術組（P＜0.05），均差異有統計學意義；與腎I/R組相比，腎氣丸組（低劑量組和高劑量組）SOD活性升高（P＜0.05），MDA含量減少（P＜0.05），差異有統計學意義；與腎氣丸低劑量組比較，腎氣丸高劑量組中SOD活性升高（P＜0.05），MDA含量減少，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 C57BL6小鼠MDA、SOD的比較/±s

表2 C57BL6小鼠MDA、SOD的比較/±s

注：MDA為血清丙二醛，SOD為超氧化物歧化酶；與假手術組比較，a P＜0.05；與腎I/R組比較，b P＜0.05；與腎氣丸低劑量組比較，c P＜0.05

SOD/（U/mL）175.69±16.29 79.36±7.04a 95.61±9.71ab 145.72±14.68abc 126.815＜0.001組別假手術組腎I/R組腎氣丸低劑量組腎氣丸高劑量組F值P值鼠數10 10 10 10 MDA/（nmol/mL）3.75±0.33 13.21±1.39a 11.37±1.02ab 5.57±1.04abc 166.680＜0.001

2.3 各組腎I/R小鼠腎組織結構的比較 HE染色顯示，假手術組小鼠腎組織結構完整、腎小管結構清晰、腎間質無水腫、管腔無管型；與假手術組比較，腎I/R組小鼠腎小管結構出現上皮細胞水腫、脫落、小管結構腫脹、小管腔凝固壞死等病變；腎氣丸低劑量和高劑量組小鼠腎細胞組織損傷程度減輕，腎小管的上皮細胞腫脹、脫落及凝固壞死等病變損傷減輕，高劑量組較低劑量組損傷程度更輕。TUNEL染色顯示，與假手術組比較，腎I/R組、腎氣丸低劑量和高劑量組細胞凋亡增加；與腎I/R組比較，腎氣丸低劑量和高劑量組細胞凋亡減輕，且高劑量組細胞凋亡程度更輕，見圖1。

2.4 PCR及免疫組化檢測Bcl-2、Caspase-3表達水平 與假手術組比較，腎I/R組小鼠的Bcl-2表達降低［（1.96±0.18）比（0.61±0.09）］，Caspase-3表達增高［（0.45±0.06）比（1.76±0.19）］；與腎I/R組比較，腎氣丸低劑量和高劑量組小鼠的Bcl-2表達增高［（0.61±0.09）比（0.94±0.11）、（1.52±0.16）］，Caspase-3表達降低［（1.76±0.19）比（1.35±0.16）、（0.89±0.11）］；與腎氣丸低劑量比較，腎氣丸高劑量組小鼠的Bcl-2表達增高［（0.94±0.11）比（1.52±0.16）］，Caspase-3表達降低［（1.35±0.16）比（0.89±0.11）］，見圖2～4。

2.5 各組腎組織中PI3K、AKT蛋白表達測定 蛋白質印跡法（Western blot）蛋白含量檢測顯示，與假手術組組比較，腎I/R組PI3K、AKT蛋白表達均顯著降低［（0.81±0.09）比（0.09±0.01），（0.86±0.11）比（0.11±0.01），P＜0.05］；與腎I/R組比較，腎氣丸組PI3K、AKT蛋白表達升高，差異有統計學意義［（0.09±0.01）比（0.23±0.02）比（0.45±0.05），（0.11±0.01）比（0.27±0.03）比（0.53±0.06），P＜0.05］；與腎氣丸低劑量組比較，腎氣丸高劑量組中PI3K、AKT蛋白表達升高，均差異有統計學意義［（0.23±0.02）比（0.45±0.05），（0.27±0.03）比（0.53±0.06），P＜0.05］，見圖5。

3 討論

腎缺血再灌注損傷是急性腎損傷（AKI）的主要病因，目前沒有可靠有效的治療方法改善預后及降低死亡率［15-16］。腎I/R損傷的有多種發病機制，其中腎組織中氧自由基等活性氧的增多是導致腎I/R損傷的主要原因之一，在疾病發生、發展的過程中起到重要作用［17］。當機體發生腎I/R時，會產生大量氧自由基，同時，機體清除氧自由基的能力下降，導致氧自由基大量堆積，從而誘導細胞凋亡，最終導致機體組織功能障礙［18-19］。超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）是抗氧化機制中兩個非常重要的衡量指標［20-21］。在損傷過程中細胞凋亡的發生亦十分關鍵，相關因子Bcl-2、Caspase-3均參與其中，并且，研究發現Bcl-2可激活促凋亡因子Caspase-3等其它因子，引起凋亡的發生［22］。

腎氣丸出自《金匱要略》，是治療腎氣虧虛證的經典方，具有陰陽雙補、腎虛得復、元氣充足等功效，能夠延緩損傷、激活組織器官功能。研究發現腎氣丸可減少肝細胞的脂性凋亡及抗生精細胞凋亡［9-10］。本研究發現，與假手術組比較，腎I/R損傷組小鼠腎組織中SOD活性顯著降低，MDA含量顯著升高；與腎I/R損傷組比較，腎氣丸低、高劑量組小鼠腎組織中SOD活性顯著升高，MDA含量顯著降低，表明經腎氣丸干預后，可提高腎組織細胞對ROS的清除能力，結果提示腎氣丸可能通過抑制腎組織細胞的氧化應激，從而對腎I/R損傷具有保護作用。并且，通過HE及TUNEL染色表明，與腎I/R組相比，腎氣丸低劑量和高劑量組小鼠腎細胞組織損傷程度減輕，腎小管的上皮細胞腫脹、脫落及凝固壞死等病變損傷減輕，高劑量組較低劑量組損傷程度更輕。結果提示腎氣丸可有效抑制腎組織細胞損傷及凋亡。免疫組化可見，與假手術組比較，腎I/R組小鼠的Bcl-2表達降低，Caspase-3表達增高；與腎I/R組比較，腎氣丸低劑量和高劑量組小鼠的Bcl-2表達增高，Caspase-3表達降低；與腎氣丸低劑量比較，腎氣丸高劑量組小鼠的Bcl-2表達增高，Caspase-3表達降低。本研究結果提示腎氣丸可抑制氧化應激反應，降低腎組織細胞凋亡，減輕小鼠I/R誘導的急性腎損傷，從而為臨床使用腎氣丸治療急性腎損傷治療提供了堅實的理論基礎。

P13K/Akt信號通路在細胞生長、發育、分化和凋亡等生理過程中發揮重要作用。經過活化的P13K通過激活Akt，進而調控下游的多條信號通路，如Caspase、Bax/Bcl-2等信號通路，產生級聯反應，參與細胞的多種生理過程［23］。其中，作為P13K/Akt信號通路的下游，Bcl-2是常見的抗凋亡蛋白［24］，Caspase-3作為核心關鍵酶參與細胞凋亡級聯反應，Caspase-3酶的水解活性超細蛋白作用可直接誘導細胞凋亡，并能損傷DNA加速凋亡［25-26］。本研究發現，腎I/R損傷后，小鼠腎組織中PI3K和AKT蛋白表達水平顯著下降；與腎I/R損傷組比較，腎氣丸低、高劑量組小鼠腎組織中PI3K和AKT蛋白水平顯著升高；與腎氣丸低劑量組比較，腎氣丸高劑量組小鼠腎組織中PI3K和AKT蛋白水平顯著升高，這提示腎氣丸可激活PI3K/AKT信號通路，抑制ROS生產，保護I/R所致的腎組織損傷。

綜上所述，本研究從體內水平研究腎氣丸在腎I/R損傷的保護機制，發現腎氣丸可通過激活PI3K/AKT信號通路對小鼠I/R誘導的急性腎損傷具有保護作用。但對臨床的指導意義仍存在不足，如給藥濃度及劑量還有待進一步完善。中藥復方腎氣丸在辨證論治的整體思想指導下進行配伍組方，往往可以通過多途徑、多靶點綜合作用于多個病理環節，從整體上有效保護腎I/R損傷。進一步深入研究腎氣丸對腎損傷的完整保護機制，將為臨床防治腎缺血再灌注損傷提供新的實驗依據。

（本文圖1～5見插圖4-2）

圖1 各組小鼠腎組織形態結構、細胞凋亡情況比較：1A為HE染色（×400），1B為TUNEL染色（×400）

圖2 免疫組紛織化學檢測B淋巴細胞癌-2（Bcl-2）（2A）、半胱氨酸天冬蛋白酶3（Caspase 3）（2B）表達水平（×400）

圖3 半胱氨酸天冬蛋白酶3（Caspase 3）mRNA表達情況

圖4 B淋巴細胞癌-2（Bcl-2）mRNA表達情況

圖5 各組小鼠腎組織PI3K、AKT蛋白表達比較：P13K為磷脂酰肌醇3-激酶、AKT為蛋白質絲氨酸蘇氨酸激酶信號通路