模擬腰椎旋轉手法抑制瞬時感受器電位離子通道香草素受體4/一氧化氮疼痛轉導通路的作用研究

韓磊，李藝，郭廣進，趙平

前期研究［1］發現，模擬腰椎旋轉手法能促使急性神經根疼痛模型大鼠痛閾短期內出現快升變化，以及背根節一氧化氮合成酶（nitric oxide synthase，NOS）表達下調，提示手法能快速改善炎性環境和異常痛敏。另有研究［2］發現，瞬時感受器電位離子通道香草素受體4（transient receptor potential vanilloid 4，TRPV4）可被機械力刺激激活，稱作一種“瞬時力傳感器”；那么旋轉手法實施過程中扳動加速度瞬間增快時的旋轉力就有可能影響TRPV4的表達?，F已證實一氧化氮（nitric oxide，NO）是TRPV4調控的下游信號分子［3］，手法促使NOS表達下調就會導致NO合成減少，因此我們推測腰椎手法有可能抑制了TRPV4/NO此通路的活化程度，從而發揮著減輕根性疼痛的作用。本研究利用建立的由腰椎間孔外口先插入鋼棒、后植入髓核誘導的大鼠神經根疼痛模型，通過研制出的模擬臨床腰椎旋轉手法的大鼠測試儀，旨在探討旋轉手法對背根節神經元上TRPV4/NO通路的調控作用。

1 材料與方法

1.1 動物與分組 清潔級雄性SD大鼠144只，體質量（150±10）g，由斯貝福實驗動物科技有限公司提供（批號15183），本研究中對于大鼠的處理符合動物倫理學標準。采用SPSS19.0軟件產生隨機數字表的方法隨機分為假手術組（n＝48）、模型組（n＝48）、模型+釕紅組（n＝48）。假手術組只在相應椎節（L5-6）左側做局部軟組織切開，未建模，作為空白對照；模型組通過手術在特定椎節（L5-6）左側建立L5神經根疼痛模型；模型+釕紅組在建模后向L5背根節注射TRPV4抑制劑釕紅（Ruthenium Red，RR）0.1 nmol。后兩組通過抑制TRPV4與否來觀察其在神經根性疼痛反應中的調控作用。

1.2 儀器與試劑 脊柱關節手法模擬裝置（國家知識產權局發明專利，專利號：ZL201310634617.4）；纖毛機械刺激針Von Frey Hairs，VFH（美國Stoeling公司）；TRPV4一抗（英國Abcam公司）；NO檢測試劑（江蘇Beyotime公司）；TRPV4拮抗劑釕紅（美國Sigma公司）。

1.3 模型制備 參照Song等［4］的大鼠背根神經節壓迫模型和課題組前期研究的神經根炎癥模型［5］，建立了在L5-6椎間孔外口先插入鋼棒“致壓”、后植入髓核“致炎”的大鼠神經根疼痛模型。

1.4 干預方式 以上三組均施行統一量化的模擬腰椎旋轉手法：將大鼠束縛固定在脊柱關節手法模擬裝置上，體位設為俯臥背伸10°，施行低速-慢加速旋轉運動。首先由中立位0°以起始速度（8.33°/s）向術側勻速旋轉25°，之后再以2倍速度（16.67 °/s）繼續加速旋轉至30°結束，最后再以起始速度（8.33°/s）恢復至中立位0°，從而完成腰椎旋轉手法的整個模擬過程。于造模后第1天開始干預，頻率1次/隔日，共計完成11次，治療期為3周。

1.5 檢測指標 每組各取24只大鼠于術后第9、21天時，即L5-6手法治療5次、11次時，深麻醉后開胸，經主動脈快速灌注法，解剖取出手術同側的L5背根神經節（dorsal root ganglion，DRG），其中18只用于TRPV4檢測；6只用于NO檢測。

TRPV4通道蛋白的表達：采用蛋白質印跡法檢測，3個L5DRG作為一個樣本，提取組織總蛋白，使用BCA蛋白質定量法進行蛋白定量后，經聚丙烯酰胺凝膠電泳，加入TRPV4一抗孵育過夜，沖洗后再加入辣根過氧化物酶標記的二抗1.5 h，化學發光顯色、顯影、定影處理，獲取目的條帶，并與內參β-actin的光密度做比較。

NO代謝產物亞硝酸鹽含量：采用Griess Reagent法檢測，按50微升/孔，在96孔板中加入用DMEM+10%緩沖液稀釋的標本，向孔中再加入配制好的GriessⅠ和GriessⅡ，于37℃孵箱中反應10 min，待反應液完全混勻后，于540 mm波長檢測各孔OD值，擬合亞硝酸鹽反應曲線，計算亞硝酸鹽含量。

1.6 統計學方法 采用SPSS19.0統計軟件進行分析。所有數值用±s表示。計量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，組內前后兩兩比較采用配對t檢驗。檢驗水準α＝0.05。

2 結果

2.1 三組間TRPV4通道蛋白表達比較 經蛋白質印跡法條帶（內參為β-Actin）比較，發現模型組TRPV4為高表達，模型+釕紅組TRPV4表達比模型組減弱，但仍強于假手術組。以術后第9天為例，見圖1。經腰椎旋轉手法干預后，SNK檢驗顯示三組間TRPV4蛋白平均灰度值完全不相等，而且兩兩比較均差異有統計學意義（均P＜0.001）。見表1。

2.2 三組間NO代謝產物 經腰椎旋轉手法干預后，SNK-q檢驗顯示三組間亞硝酸鹽含量均值完全不相等，而且兩兩比較均差異有統計學意義（均P＜0.001）。因此，在術后第9、21天時模型組亞硝酸鹽含量均明顯低于模型+釕紅組，但均明顯高于假手術組。見表1。

表1 不同處理組術后第9和21天瞬時感受器電位離子通道香草素受體4（TRPV4）蛋白平均灰度值和亞硝酸鹽含量比較/（nm/mL，±s）

表1 不同處理組術后第9和21天瞬時感受器電位離子通道香草素受體4（TRPV4）蛋白平均灰度值和亞硝酸鹽含量比較/（nm/mL，±s）

注：與假手術組比較，a P＜0.001；與模型組比較，b P＜0.001

分組假手術組模型組模型+釕紅組F值P值樣本TRPV4蛋白平均灰度值 亞硝酸鹽含量術后21 d 3.84±0.08 5.31±0.19a 9.45±0.27ab 6 045.89 0.000 0數 6 6 6術后9 d 1.14±0.37 3.53±0.93a 2.41±0.75ab 18.20 0.000 0術后21 d 0.60±0.13 1.59±0.48a 1.05±0.24ab 16.62 0.000 0術后9 d 6.23±0.15 9.17±0.24a 11.36±0.33ab 2 669.98 0.000 0

3 討論

3.1 TRPV4/NO通路是調控神經根疼痛敏感狀態的重要信號轉導通路之一 研究表明，疼痛敏感狀態多是由于DRG受損細胞的興奮性增高和異位電活動引起的，而多種離子通道被認為與DRG炎性損傷后的高興奮性有關［6-8］，如電壓門控性鈉離子通道和鉀離子通道、超極化激活性陽離子通道、機械敏感性離子通道等。其中，瞬時感受器電位離子通道家族中的香草素受體TRPV家族越發獲得當前的廣泛關注。TRPV家族包括TRPV1-6，其基因和拓撲結構都較相近。其中TRPV4是大鼠DRG上的一種多覺型感受器，可被機械刺激、低滲、低PH值、佛波醇酯等激活，同時參與介導機械性痛敏和炎癥性痛敏［9-12］。因此，當TRPV4出現高表達就意味著DRG神經痛敏狀態的存在。TRPV4受體的激活可以引起DRG神經元細胞內大量鈣離子內流，導致具有鈣離子依賴性的一氧化氮合成酶促進L-精氨酸合成NO。NO是參與介導傷害性疼痛信號傳遞中的重要介質，它既能通過cGMP-PKG通路促進興奮性神經遞質-谷氨酸（Glu）的釋放，又能通過此通路減緩抑制性神經遞質-氨基丁酸（GABA）電流；同時又能增加降鈣素基因相關肽（CGRP）的表達量［13-15］。綜上所述，DRG損傷模型大鼠傷害性疼痛信號的傳遞途徑可能是：DRG持續壓迫和炎癥刺激能夠增加TRPV4的表達和功能，導致細胞內鈣離子內流增多，增加鈣離子依賴性NOS表達，催化L-精氨酸合成NO，進一步調節下游的cGMP-PKG級聯反應，并調節突觸聯系，促進Glu等興奮性神經遞質和CGRP等神經肽類物質的釋放，從而調節傷害性疼痛信號的傳遞，這就是TRPV4/NO信號通路增高DRG細胞損傷后的電興奮，參與介導炎癥性痛敏的全過程。因此，TRPV4介導其下游信號分子NO合成，繼而促進痛敏信號的傳遞；TRPV4/NO信號通路與痛敏狀態密切相關，活化TRPV4/NO信號通路對痛敏狀態有調控作用。

3.2 腰椎旋轉手法可能通過抑制TRPV4/NO信號通路而緩解根性疼痛和痛覺敏感 近年來有學者指出，腰椎旋轉手法之所以產生療效并一直沿用至今，其所謂“筋歸槽”“骨合縫”機制的關鍵環節很可能與其力學效應觸發了自身神經-內分泌網絡系統反饋調節的生物學效應——“抗炎鎮痛作用”有關［16-18］。腰椎旋轉手法的治療干預呈現的是一種物理形式的機械力在肌骨組織應力點上的傳達，在某種特定的椎間關節相對運動中可以通過減緩反應性關節高張力，而對神經根及其周圍組織的缺血狀態產生影響。通過微環境的血運改善，細胞缺氧狀態逐漸緩解，以及細胞膜張力發生變化，機械敏感性離子通道亦隨之呈現相應變化，細胞膜上的機械張力信號向細胞內傳導就轉換成電信號或生化信號，進而促使炎性痛敏信號的減弱。這種機械-電信號/化學信號轉換過程可能提示了：其可能是旋轉手法“生物應力效應”轉換為“生物抗炎效應”的關鍵所在。

鑒于TRPV4/NO信號通路在DRG神經痛敏中的傳遞途徑和調控作用，它可能在“力學效應-抗炎效應”兩者之間起著重要的“橋梁”作用。TRPV4由于自身對機械刺激敏感特性，可作為“瞬時力傳感器”對旋轉手法產生的牽張力學刺激產生反應。本研究證實，在適度手法干預后可以使得模型組NO的生成減少；然而通過釕紅阻斷TPRV4感受力學信號的作用，旋轉手法減少NO含量的效果就會明顯降低，其抗炎鎮痛效應就被削弱。也就是說，TRPV4/NO通路被抑制與腰椎旋轉手法快速抗炎鎮痛效果有密切關系，腰椎旋轉手法迅速緩解DRG神經痛敏的作用很可能與調控DRG神經元上的TRPV4/NO通路有關。

此外，本研究模擬了一種腰椎關節松動手法，其運動力學特征是低速度、慢加速、低幅度的旋轉運動［19-20］，也就是說通過一個增力輕柔但穩定的扭轉力作用到病變節段的關節囊及DRG，即可活化TRPV4/NO通路達到快速鎮痛的效果，為臨床如何適度控制手法力度、發揮手法效應和減少副損傷提供了重要的參考依據。模擬不同力學形式的手法進行抗炎鎮痛效應的相互比較將是下一步研究的重點。