過氧化氫酶表達與腰椎管狹窄癥病人黃韌帶肥大

陳通，陳煥詩，易軍飛

腰椎管狹窄癥（LSCS）是最常見的脊柱疾病之一。而黃韌帶（LF）肥大在LSCS的發生中起重要作用［1］。當黃韌帶中彈性蛋白與膠原蛋白的比例降低時，彈性降低，僵硬或纖維化增加。這導致椎管狹窄，壓迫硬膜囊和神經根，即使在沒有纖維環，突出的髓核或骨刺的情況下也會導致癥狀［2］。雖然黃韌帶的肥大和纖維化被認為是由于衰老過程繼發的退行性變化和繼發于不穩定性的機械應力而發生的，但黃韌帶肥大的精確發病機制仍然未知［3］。以前的研究報道了各種分子在椎管狹窄病人中的表達和活性增加，包括基質金屬蛋白酶（MMPs）、miR-155、轉化生長因子β1（TGF-β1）、結締組織生長因子、骨形態發生蛋白和炎性細胞因子［4］。例如，有研究表明黃韌帶成纖維細胞中活性MMPs（MMP-2和MMP-13）的表達增加可能與患有LSCS的病人的彈性蛋白降解和黃韌帶纖維化有關［5］。椎管狹窄病人的MMP-2和MMP-13值明顯高于椎間盤突出癥病人。其他研究表明，由黃韌帶成纖維細胞合成并增加膠原合成的TGF-β1與肥大有關［6］。之前有研究者探討了黃韌帶肥大與miRNA表達之間的關系，發現miR-155在腰椎黃韌帶肥大病人中表達上調［7］。他們還報道了miR-155的表達水平與黃韌帶的纖維化厚度和程度相關［8］。DNA損傷和核堿基不穩定也可能導致LSCS。氧化應激是由促氧化劑和抗氧化劑穩態失衡引起的，可能導致產生高水平的活性氧（ROS）。已知高水平的ROS會對人體細胞中的脂質，蛋白質和DNA造成損害［9］。之前的研究證實LSCS病人在肥大性黃韌帶中的氧化性DNA損傷高于非病理性黃韌帶?；谶@些發現，我們預測肥大黃韌帶樣品中過氧化氫酶基因表達的改變。過氧化氫酶在所有主要的身體器官中表達，尤其是肝臟，腎臟和紅細胞，并且在細胞防御氧化應激中起重要作用。因此，我們假設缺乏過氧化氫酶，其催化過氧化氫進入水和氧氣以保護生物免受自由基侵害，在黃韌帶肥大中起作用。已知自由基會破壞細胞和組織［10］，導致許多組織的感染［11］，智力下降，免疫力下降［12］，關節疾病，心臟?。?3］和纖維化。據我們所知，以前沒有研究過氧化氫酶基因表達與黃韌帶肥大之間的關聯。

1 資料與方法

這項回顧性研究于2013年1月至2015年12月間在柳州市柳鐵中心醫院脊柱科診所進行。病人或其近親屬知情同意，本研究符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》相關要求。

1.1 一般資料 研究對象包括75例L4-L5水平LSCS減壓性椎板切除術病人（LSCS組）和75例腰椎間盤突出癥對照組（LDH組），磁共振成像（MRI）無黃韌帶肥大的證據。排除標準是先前的腰椎間盤手術，椎骨骨折，任何感染跡象，糖尿病，腫瘤或任何惡性腫瘤。椎管＜10 mm被認為是椎管狹窄。所有手術均由本研究的筆者進行。筆者和1名熟練的放射科醫師在矢狀位和軸位T1和T2加權MRI上確認了LSCS和LDH。MRI在SIEMENSMR AEREA（1.5特斯拉）掃描儀上進行。

1.2 樣品收集和黃韌帶厚度的測量 在手術干預期間獲得黃韌帶樣品，從所有病人獲得了整個黃韌帶樣本層。從黃韌帶樣本中除去硬膜外脂肪，使用卡尺測量最厚點，精確到0.01 mm。在2個不同的點測量黃韌帶厚度，并且使用最大厚度進行分析。

1.3 組織學分析 將每個樣品的一半固定在4%中性甲醛中，并用20%乙二胺四乙酸脫鈣4～6周。接下來，將樣本包埋在石蠟中用于組織學分析。Masson三色染色用于評估纖維化程度，并且蘇木精和伊紅染色用于評估彈性蛋白降解。組織學分析由2位病理學家獨立完成。

1.4 Masson三色染色 對黃韌帶纖維化的嚴重程度進行分級：0級表示正常組織，1級表示整個區域纖維化＜25%，2級表示整個區域纖維化25%～50%，3級表示50%～75%纖維化，4級表示＞75%纖維化。

1.5 蘇木精和伊紅染色 對黃韌帶彈性蛋白降解的程度進行分級：0級表示正常組織無彈力蛋白降解區，1級表示整個區域彈力蛋白降解率＜25%，2級表示25%至50%彈性蛋白降解，3級表示彈力蛋白降解50%～75%，4級表示彈力蛋白降解＞75%。

1.6 免疫組織學分析 對于免疫組織學染色，在切片機上切割連續切片，在二甲苯中脫蠟，并在醇溶液中再水合。接下來，在3 000 r/min時用胎牛血清對100 mg黃韌帶組織進行勻漿（組織-Tearor，985370-04；BioSpec產品公司）。然后在裂解緩沖液（50 mM Tris-HCl，pH 7.5，10 mm乙二胺四乙酸，50 mm 氯化鈉，0.02% 疊氮鈉（NaN3），1%nonidet P-40，0.25 mm二硫蘇糖醇）中裂解。在1 500轉/秒，4℃下離心30 min后，獲得上清液。為了分析每個樣品，將30μg蛋白質加載到12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠上。使用二辛可寧酸蛋白質測定試劑盒（Pierce BCA蛋白質測定試劑盒no 23225，Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA；Pierce Company）測定裂解的黃韌帶組織的蛋白質濃度。電泳后，使用轉移緩沖液將蛋白質轉移至150 V的聚偏二氟乙烯膜（Millipore，St Quentin，Yvelines，France）2 h。在將非特異性結合位點封閉過夜后，將膜與對過氧化氫酶特異的純化兔多克隆抗體（兔抗過氧化氫酶；Cortex Biochem，CR2157RP，San Leandro，California）一起溫育。對甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）特異的小鼠抗體用作所有樣品的蛋白質加載的內部對照［GAPDH抗體（0411）：sc-47724］。使用增強的化學發光（Amersham Life Sciences，Piscataway，NJ）使結果可視化。使用成像密度計GF670和分子分析軟件（Bio-Rad，SAFCBioscience，Sigma-Aldrich）對每個樣品3×量化印跡，并將平均值用作最終密度。密度表示為平均值±標準偏差（任意單位）。

1.7 統計學方法 分類變量表示為平均值和范圍。Mann-WhitneyU檢驗用于評估兩組之間黃韌帶彈性蛋白降解程度，纖維化程度和平均光密度（OD）的差異。P＜0.05表示差異有統計學意義。使用SPSS 12.0版統計分析軟件（SPSSInc，Chicago，IL）分析所有數據。

2 結果

2.1 兩組一般情況比較 兩組一般情況比較見表1，兩組在年齡（P＝0.850）或性別（P＝0.751）方面差異無統計學意義。

2.2 黃韌帶樣品的厚度 在外科手術期間測量的平均黃韌帶厚度在LSCS組中為5.99mm（范圍為4.50～7.02 mm），在LDH組中為（2.95±0.6）mm，范圍為1.98～3.2 mm。LSCS組的平均黃韌帶厚度較高（5.99±0.86）mm，范圍為4.5～7.02 mm，差異有統計學意義（P＝0.004）。

表1 腰椎管狹窄（LSCS）75例和腰椎間盤突出癥（LDH）75例一般情況比較

2.3 彈性蛋白降解和黃韌帶的纖維化 在LDH（對照）病人中，組織學圖像顯示豐富的正常彈性蛋白纖維以嚴格平行或規則的排列組織。相比之下，在LSCS病人中，彈性蛋白降解程度非常高，蘇木精和伊紅染色顯示彈性纖維排列不規則。LSCS病人標本中彈性蛋白降解的平均等級高于LDH病人，（3.04±0.50）比（0.79±0.60），差異有統計學意義（t＝7.997，P＝0.007）。LSCS病人標本中平均纖維化分級高于LDH病人，（3.01±0.47）比（0.66±0.42），差異有統計學意義（t＝8.765，P＝0.005）

對病人組織進行的免疫組織化學研究顯示，LDH組病人的組織中的陽性染色成纖維細胞顯著低于LSCS組病人，（14.23±6.81）比（61.36±15.29），差異有統計學意義（t＝12.592，P＝0.001）。

2.4 過氧化氫酶表達 黃韌帶細胞培養上清液的明膠酶譜顯示LSCS病人樣品中過氧化氫酶活性持續降低。在從LDH病人獲得的黃韌帶細胞培養物上清液中，觀察到較高的過氧化氫酶活性，使用GAPDH進行標準化。LSCS組的OD為（61.80±31.10），LDH組的OD為（152.80±41.13）。LSCS組的平均OD值低于LDH組（t＝15.196，P＝0.009）。

3 討論

黃韌帶覆蓋椎管的后壁和側壁。隨著黃韌帶變厚，椎管開始變窄并且神經結構被困在管內［14］。在本研究中，手術期間進行的測量顯示，LSCS病人的平均黃韌帶厚度高于LDH病人。我們還證明了大多數肥大黃韌帶樣本區域存在不規則排列，破裂，腫脹和減少的彈性纖維以及纖維化增加。先前報道過黃韌帶厚度，彈性喪失和纖維化評分之間的正相關關系［15］。我們的結果與之前的研究結果一致，我們加入對照組可以加強這些發現。

此外，我們試圖確定哪些生化因子可能導致組織學變化和LSCS。已知過氧化氫酶在體內各種結締組織中減少結構蛋白如膠原蛋白和血管生成素的分泌。以前的研究表明過氧化氫酶的過表達可以防止纖維化［16］?；谶@些發現，我們假設缺乏過氧化氫酶可能在黃韌帶肥大中發揮作用。在本研究中，我們觀察到肥大黃韌帶樣品的血管周圍區域中過氧化氫酶基因表達降低。眾所周知，過氧化氫酶可保護細胞免受氧化應激［17］。過氧化氫酶活性的降低導致異常的上皮修復，上皮損傷與纖維化發展過程中過氧化氫酶的功能缺陷有關［18］。有報道稱細胞外ROS增加基質沉積并導致細胞纖維化增加［14］。ROS也被稱為反應性化學實體，廣泛參與細胞信號傳遞、代謝、存活和凋亡，從而調節許多生理和病理過程，包括細胞生長、纖維化、收縮/擴張和炎癥［20］。因此，我們的結果提示，缺乏過氧化氫酶，消除了ROS，可能參與了黃韌帶肥大的機制，從而導致LSCS。這是關于過氧化氫酶和黃韌帶肥大之間關系的第一項研究，可能提出了LSCS的新治療策略。

本研究表明彈性蛋白降解和纖維化增加與黃韌帶肥大密切相關，這與過去的研究一致。此外，我們報道了LSCS病人缺乏過氧化氫酶，這是一種抗氧化酶。我們希望這些新發現為未來的研究打開一扇門。