血管內皮生長因子和性別決定區Y框蛋白2在胃癌中的表達及與預后的關系

趙璐，杜小明

胃癌是全球發病率及死亡率較高的消化系統惡性腫瘤［1］，其中有約30%的病例發生在中國，而且中國每年有約10萬人死于胃癌［2］。雖然D2根治性手術及術后輔助化療顯著提高了胃癌病人的5年生存率，但是對于局部晚期胃癌以及出現復發轉移后的胃癌，當前的內科治療療效尚不理想。胃癌是一種異質性惡性腫瘤，這是其在相同臨床分期病人中預后不同以及對標準治療反應不同的主要原因，而基因組的復雜性和異質性是決定臨床預后的腫瘤表型特征的根本原因［3］。因此，了解胃癌的分子和遺傳特征對胃癌的有效和個性化管理至關重要。文獻顯示腫瘤干細胞（cancer stem cells，CSCs）的自我更新及異常分化在惡性腫瘤的演變過程中扮演決定性角色，并且腫瘤干細胞在腫瘤的發生發展、轉移及耐藥等方面起重要作用［4-5］。腫瘤干細胞的自我更新及分化可以通過內在通路及來自腫瘤微環境的細胞因子調節，例如血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）及性別決定區Y框蛋白2（SOX2，sex-determining region Y-box 2，SOX2）等。與大家熟知的胃癌治療靶點人表皮生長因子受體-2（HER-2）相比，VEGF與胃癌的研究近期才逐漸被報道，貝伐珠單抗和阿帕替尼聯合化療可能提升治療療效，但優勢甚微［6-8］，而近期有研究顯示SOX2是胃癌預后獨立因子［9］。因此，對于腫瘤靶向治療，研究這些調節CSCs的細胞因子則具有重要的意義。目前在腫瘤組織中同時檢測VEGF及SOX2的表達及其與臨床病理特征及病人預后的關系研究較少，而在胃癌中兩者的研究更是沒有。本研究同時檢測VEGF及SOX2的蛋白表達水平及與臨床病理特征和胃癌病人預后的關聯，為后期研究VEGF及SOX2對胃癌病人預后起到的作用提供初步實驗基礎。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2012年3月至2017年12月皖北煤電集團總醫院理科存檔的胃癌手術標本40例。術前未接受放、化療，臨床病歷資料完整。年齡范圍為42～70歲，中位年齡58歲。男28例，女12例。根據第七版UICC/AJCC胃癌分期標準，臨床分期為Ⅰ～Ⅱ期16例，Ⅲ～Ⅳ期24例。依據2016年WHO診斷標準，病例分級為高分化9例，中分化12例，低分化19例。腫瘤侵犯固有肌層及以上18例，腫瘤侵犯漿膜層及以下共22例。有淋巴結轉移者23例，無淋巴結轉移者17例。40例病例均獲得隨訪資料，隨訪時間12～60個月，癌旁組織32例，取自胃癌切除或胃鏡活檢病人。

1.2 試劑 兔抗人單克隆VEGF抗體（NeoMarkers公司，工作液稀釋度1∶75），SOX2兔抗人多克隆抗體（NeoMarkers公司，工作液稀釋度1∶75），中性甲醛固定液、乙醇、二甲苯、枸櫞酸鹽、Z中性樹膠及過氧化氫均為國產產品，EnVision試劑盒購自于丹麥Dako公司，DAB顯色液均由實驗人員自行配制，購自上海睿鉑賽生物科技有限公司的Envision試劑盒（DAB+CHROMOGEN C試劑液和SUBSTRATE BUFFERB試劑液），按1∶100的稀釋度配置DAB顯色溶液。

1.3 實驗方法 免疫組織化學采用EnVision法。（1）首先標記切片；（2）然后放入65℃烤箱，將烤好的切片依次輕放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ溶液中；（3）然后將脫蠟后的切片按順序浸入裝有梯度乙醇溶液的液缸中；（4）采用微波修復方法，將切片放入微波爐中高火加熱15 min；（5）將修復完的切片浸入新配制的3%甲醇雙氧水溶液中；（6）切片用PBS緩沖液震洗三次，將切片放入雙氧水中，室溫下孵育10 min；（7）每張切片滴加已稀釋至最佳工作濃度的一抗各160μL，然后4℃冰箱孵育過夜；（8）次日每張切片均滴加二抗各160μL，放入37℃恒溫箱，孵育30 min；（9）每張切片的組織部位滴加DAB顯色液100μL，顯微鏡下觀察組織顯色情況，顯色完成后迅速用自來水沖洗；（10）切片放入蘇木素染液缸中復染，鹽酸乙醇浸洗，再放入乙醇中脫水，最后放入二甲苯中，取出后中性樹膠封片。

1.4 結果判定 VEGF主要定位于細胞質，少數伴細胞核著色；SOX2主要定位于細胞核，部分伴有胞質及胞膜著色，染色陽性結果判斷標準如下［10-11］：（1）陽性細胞率：＜5%計0分，6%～25%計1分，26～50%計2分，51%～75%計3分，＞75%計4分；（2）染色強度：無色計0分，淺黃色計1分，棕黃色計2分，棕褐色計3分。由兩項積分相加進行評分，兩者乘積＜2分為陰性表達（-），＞2分為陽性表達（+）。

1.5 統計學方法 采用SPSS17.0進行統計分析。計數資料采用χ2檢驗（當所有例數≥5時，用Pearsonχ2檢驗，若所得P≈0.05時，用Fisher精確檢驗，當1≤例數＜5時，用連續校正χ2檢驗），兩種蛋白之間的相關性檢驗采用Spearman秩相關分析，生存分析應用Kaplan-Meier法，用Long-rank檢驗進行多組比較，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 VEGF和SOX2在胃癌組織和胃癌癌旁正常組織中的表達 如圖1所示，VEGF蛋白多定位于胃癌癌細胞的細胞質，少數定位于細胞膜，SOX2蛋白多數定位于胃癌癌細胞的細胞核，VEGF和SOX2在胃癌組織中的表達率分別為70.0%（28/40）和65.0%（26/40），與癌旁正常組織相比，二者表達差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 胃癌手術標本40例中胃癌組織與癌旁正常組織血管內皮生長因子（VEGF）及性別決定區Y框蛋白2（SOX2）表達比較

2.2 VEGF和SOX2的表達與胃癌臨床病理參數的關系 在胃癌淋巴結轉移（+）病人中，VEGF和SOX2蛋白陽性表達顯著高于無淋巴結轉移（-）病人，差異有統計學意義（P＜0.05）；在胃癌分期Ⅲ～Ⅳ期的病人中，VEGF和SOX2蛋白陽性表達顯著高于Ⅰ～Ⅱ期病人，差異有統計學意義（P＜0.05）；在T3～4及低分化病人中，VEGF蛋白陽性表達較T1-2及高分化病人顯著上調，差異有統計學意義（P＜0.05），而SOX2蛋白陽性表達則差異無統計學意義；胃癌組織中，VEGF和SOX2的陽性表達與病人的年齡性別未見明顯關聯（表2）。

表2 胃癌病人血管內皮生長因子（VEGF）及性別決定區Y框蛋白2（SOX2）表達與臨床病理系數關系

2.3 胃癌組織中VEGF和SOX2的表達的相關性在胃癌組織中，VEGF與SOX2的表達呈正相關關系（rs＝0.375，P＝0.017），見表3。

2.4 VEGF和SOX2的表達與胃癌病人預后的關系 生存分析結果顯示，VEGF陽性表達組中中位OS（50%的個體存活時間）為28個月（95%CI：21～35個月），而VEGF陰性表達組中中位OS顯著高于VEGF陽性表達組，差異有統計學意義（P＝0.001）（圖2A）。SOX2陽性表達組中中位OS為28個月（95%CI：22個月～34個月），與陰性組者40個月（95%CI：23個月～57個月）相比明顯減少，差異有統計學意義（P＝0.040）（圖2B）。VEGF、SOX2同時陽性表達組中中位OS為28個月（95%CI：22個月～34個月），與同時陰性表達者中位OS及VEGF或SOX2僅1種表達者中位OS：37個月（95%CI：21個月～53個月）相比減少明顯，差異有統計學意義（P＝0.010）（圖2C）。

表3 胃癌組織中血管內皮生長因子（VEGF）與性別決定區Y框蛋白2（SOX2）表達的相關性

圖2 血管內皮生長因子（VEGF）及性別決定區Y框蛋白2（SOX2）表達與胃癌病人生存預后關系：A為VEGF表達陽性和陰性與胃癌病人預后關系，B為SOX2表達陽性和陰性與胃癌病人預后關系，C為VEGF及SOX2兩者不同表達狀態下與胃癌病人預后關系

3 討論

我國胃癌的總體5年生存率為30%～50%，其中一線治療失敗者對二線治療如果始終有反應，則生存時間長于對二線化療無反應者，但有接近40%的一線治療后病情進展的病人對二線化療無反應［10］。所以近年來對胃癌新靶點藥物的研究日漸增多，目前NCCN已推薦對于不可手術的局部晚期、復發或轉移性胃/胃食管結合部腺癌病人，如HER-2過表達，曲妥珠單抗聯合化療可作為一線治療［11］。其他如EGF/EGFR、VEGF/VEGFR、ALK、MET和m-TOR等分子和信號通路被研究的最多。而其中VEGF不僅在腫瘤血管生成過程中起最關鍵的作用，而且還可以刺激包括造血干細胞、神經干細胞、內皮細胞等多種干細胞自我更新［12］。新的研究顯示在膠質瘤及皮膚癌中，VEGF可以維持CSCs的干細胞狀態［13］。SOX2基因位于3q26.33，編碼317氨基酸轉錄因子，包含HMG域，可以調節胚胎干細胞的自我更新及分化，及維持體細胞向多潛能干細胞方向分化［14］，研究顯示SOX2在乳腺癌、胃癌、肺癌及卵巢癌中的CSCs中高表達，并且可以維持CSCs的干細胞狀態，提示SOX2在這些癌癥的發生、發展過程中起重要作用［15-17］。Zhao等［18］和Kim等［19］研究顯示在肺癌細胞及乳腺癌細胞中，VEGF可以通過VEGFR-2/Stat3信號通路誘導SOX2從而抑制miR-452和驅動Slug，進而維持腫瘤干細胞的自我更新和轉移，提示VEGF和SOX2可能在肺上皮及乳腺上皮的癌變過程中起關鍵角色。且本課題組研究結果顯示VEGF及SOX2的高表達可能提示肺鱗癌病人有著較差的預后［20］。而此次為了研究VEGF和SOX2對胃癌發生轉移及預后的作用，本課題組觀察了VEGF及SOX2在胃癌和癌旁正常組織的表達情況，并用統計學方法分析VEGF和SOX2蛋白的表達與臨床參數的關系以及與胃癌病人預后的關聯。

本研究結果表明VEGF在胃癌組織明顯高表達，VEGF的高表達可能促進胃癌的淋巴結轉移、出現更差的分化、更易出現血行轉移及預示更晚的臨床分期，生存分析回示VEGF預示著胃癌病人有著更差的預后。本研究結果與前期發表的VEGF和胃癌的研究結果相似，Chen等［21］及Pang等［22］的研究顯示VEGF的表達與腫瘤大小、TNM分期、淋巴結轉移呈顯著正相關。生存分析顯示，高VEGF表達與胃癌病人預后不良有顯著相關性，且VEGF表達是胃癌病人總生存率的獨立預后參數，甚至可能為胃癌的診斷提供了新的線索。近年來對CSCs的基礎研究和轉化研究進展迅速，研究表明SOX2表達測定可作為胃CSCs分離鑒定的標志物，但是SOX2表達與病理參數和病人生存的關系仍存在爭議，早年間SOX2被報道為一種腫瘤抑制因子通過調節細胞周期蛋白D1、磷酸化Rb或p27水平從而抑制細胞生長，此外，SOX2已經被證明可以抑制遷移p21表達上調對胃癌的侵襲作用。但近年來越來越多的研究表明SOX2在胃癌的發生發展中起致癌基因的作用，抑制SOX2的表達可減少胃癌細胞的增殖、遷移和致瘤潛能，并破壞腫瘤干細胞樣表型［23-25］。這和我們的研究結果相似，SOX2在胃癌中的高表達，可能促進胃癌病人淋巴結轉移及提示這些病人的臨床分期較晚，且SOX2的高表達預示著這些病人有著更差的預后。

迄今，關于VEGF和SOX2在腫瘤中的研究較少，文獻報道二者在腫瘤中聯系可能由下列兩種機制所致：（1）VEGF通過VEGF受體-2（VEGFR-2）/stat3介導的Myc和SOX2的上調促進乳腺癌和肺癌干細胞（CSC）的自我更新，VEGF高表達的腫瘤最有可能通過上調VEGF逃避抗血管生成藥物，促使CSC自我更新，在治療后重新增殖。（2）VEGFA誘導SOX2表達可促進EMT和腫瘤轉移。在乳腺癌細胞系和原發性腫瘤培養中，VEGFA快速上調SOX2表達，導致SNAI2誘導、EMT、侵襲轉移增加。除了血管生成作用外，VEGFA還上調SOX2來驅動干細胞擴增，同時miR-452缺失和Slug上調，為腫瘤干細胞獲得轉移潛能提供了一種新的機制［18-19］。而我們的研究結果顯示，胃癌組織中VEGF與SOX2的表達呈正相關關系，這一結果與上述報道細胞水平研究結果相一致，并且生存分析顯示VEGF和SOX2同時高表達的病人與僅一種表達或都不表達的病人相比生存時間明顯降低，而且單因素分析結果顯示VEGF與SOX2的單獨高表達提示這些胃癌預后較差。但是這一結果仍需要后期加大樣本量和減少生存分析刪失數目的研究來進一步驗證。

綜上所述，VEGF和SOX2在胃癌的癌變進展演變中扮演重要角色，同時可能存在著VEGF-VEGFR-2/JAK2/STAT3-SOX2這一信號軸，做為胃癌后期靶向治療研究方向。而且迄今為止，抗VEGF在腫瘤靶向治療中取得的成功有限，考慮與抗血管生成藥物導致腫瘤缺氧，進而導致VEGF和CSC均上調相關。我們希望將VEGF與腫瘤的發生和轉移潛能的獲得聯系起來的機制見解，最終為VEGF通路靶向研究產生新的策略。

（本文圖1見插圖4-4）

圖1 血管內皮生長因子（VEGF）及性別決定區Y框蛋白2（SOX2）在胃癌及癌旁正常組織的表達情況：A為VEGF在胃癌組織的表達情況，B為VEGF在癌旁正常組織的表達情況，C為SOX2在胃癌組織的表達情況，D為SOX2在癌旁正常組織的表達情況