microRNA-21在神經膠質瘤患者外周血清中的表達及意義

徐敏 黃攀 何曉英

(1德陽市第二人民醫院神經內外科，四川 德陽 618000；2德陽市人民醫院；3西南醫科大學附屬醫院)

神經膠質瘤(Neuroglioma)是最常見的原發性中樞神經系統腫瘤，約占顱內腫瘤的50%，發病率和死亡率均較高〔1〕，手術切除是目前最主要的治療方式，然而由于腫瘤細胞常呈浸潤性生長，與正常腦組織邊界不明顯，手術常難以完全清除干凈，因此，積極探索更加有效的治療方式極有必要〔2〕。隨著醫學技術的發展，醫學發展模式已經從對癥治療轉變為對因治療，因此只有將神經膠質瘤的發病機制研究得更加透徹才能尋找到更加有效的治療方式〔3〕。microRNA是一類長度17～22個核苷酸序列的非編碼小分子物質，可通過與靶基因的mRNA結合進而影響轉錄后翻譯的過程從而發揮調控機體生長發育和疾病發生的作用〔4〕。microRNA-21是一種與腫瘤關系密切的小分子RNA〔5〕，研究顯示在多種實體腫瘤的病理組織或外周血中均存在microRNA-21的表達量增高〔6〕。然而在神經膠質瘤患者外周血清中microRNA-21的表達情況及microRNA-21的分子調控網絡尚未見報道。本研究擬通過RT-PCR技術及生物信息學分析的方法進行預測。

1 資料與方法

1.1研究對象 選擇德陽市第二人民醫院收治的確診為神經膠質瘤患者53例作為試驗組，年齡31～68歲，平均(39.68±8.72)歲，男28例，女25例；另選取同期健康體檢者50例，年齡(40.24±8.84)歲，男25例，女25例。兩組年齡、性別差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2納入標準 ①符合中國中樞神經系統膠質瘤診斷與治療指南者〔7〕；②臨床資料完整者；③神志清楚能配合研究者；④知情同意；⑤首次確診為神經膠質瘤者。排除標準 ①非首次確診為神經膠質瘤或已經治療的神經膠質瘤者；②嚴重心、肝、腎功能不全者；③精神異常不能配合者。

1.3標本采集 入院時對疑診為神經膠質瘤的患者采集空腹外周靜脈血，室溫靜置15 min后離心分離收集上層血清并編號，保存于-80℃冰箱用于后期的RT-PCR；若術后病理證實為非神經膠質瘤則剔除對應編號的血清樣本。

1.4主要試劑與儀器 M-MLV 逆轉錄酶試劑盒、Trizol Reagent、10 mmol/L dNTP MIX均購于美國InvitrogenTM公司；內參基因U6及microRNA-21引物序列由武漢金德生物科技有限公司設計；M-MLV逆轉錄試劑盒購于美國Thermo Scientific公司；SYBR? Premix Ex TaqTM試劑盒購于美國TaKaRa公司；PCR儀購于美國ABI公司；熒光定量PCR儀購于Life technologies公司；超凈工作臺購于蘇凈安泰有限公司。microRNA-21的序列為：正義:5′-TGGGCTTATCAGACTGATGTTGA-3′;反義:5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTC-3′。內參基因U6序列：正義:5′-CTCGCTTCGGCAGCACAT-3′；反義:5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。本研究采用2-△Ct代表microRNA-21的相對表達量，△Ct=(目標microRNACt值-U6Ct值)。

1.5生物信息學分析 采用UCSC數據庫對microRNA-21在人類基因組中的位置及保守性進行分析；microRNA-21的靶基因預測采用TargetScan數據庫及CoMeTa數據分別進行預測，取同時出現于二者的靶基因作為microRNA-21的潛在靶基因；采用DAVID基因數據庫對microRNA-21靶基因的功能和信號通路進行富集分析。

1.6統計學處理 采用SPSS17.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1兩組外周血清microRNA-21的表達 試驗組外周血清microRNA-21的相對表達量(2.53±0.95)高于對照組(1.05±0.64)，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.2microRNA-21在人類基因組中的位置及保守性 在UCSC基因組在線數據庫中(http://genome-asia.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway?redi-rect=manual &source=genome.ucsc.edu)進行如下設置：Popular Species選擇為Human，Human Assembly選擇為Dec.2013(GRCh38/hg38)，在Position中輸入hsa-miR-21，結果顯示，microRNA-21在人類基因組中位于染色體17q23.1上的59841266-59841337位點上，長度為72 bp；而保守性分析結果顯示microRNA-21基因序列在人、小鼠、大象、雞、狗、恒河猴、非洲爪蛙、斑馬魚、七鰓鰻9個物種之間高度保守。見圖1。

圖1 microRNA-21在人類基因組中的位置及保守性分析

2.3microRNA-21可能靶基因預測 在Targetscan數據庫(http://www.target-scan.org/)中將Select a species設置為Human，在Enter a micro-RNA name中輸入miR-21-5p，結果顯示共有320個可能靶基因；而在CoMeTa數據庫(http://cometa.tigem.it/index.php)首頁中選擇miRNA target predictions(CoMeTa targets link)項，再在Type your Input中輸入hsa-miR-21-5P，結果共發現791個可能靶基因。

2.4通過繪制Venn圖預測microRNA-21潛在靶基因 通過網站(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)繪制Targetscan數據庫和CoMeTa數據庫同時出現的靶基因的Venn圖，結果發現共有146個潛在靶基因。見表1、圖2。

表1 microRNA-21靶基因

續表1 microRNA-21靶基因

圖2 microRNA-21潛在靶基因Venn圖

2.5microRNA-21靶基因功能富集(GO)分析和KEGG Pathway分析 通過DAVID(https://david-d.ncifcrf.gov/)基因數據庫對Venn圖求得的146個交集靶基因進行GO分析，結果發現microRNA-21的靶基因主要富集于RNA合成代謝、細胞增殖凋亡、轉錄、磷代謝、細胞信號傳導等過程中。而對KEGG Pathway進行分析，結果發現microRNA-21靶基因主要富集于絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路、神經營養素信號通路、Janus激酶-信號轉導與轉錄激活子(JAK-STAT)信號通路、細胞因子-細胞因子受體相互作用、趨化因子信號通路、Toll樣受體信號通路、T細胞受體信號通路、軸突導向信號通路、細胞凋亡信號通路、轉化生長因子(TGF)-β信號通路中。其中MAPK是常見的腫瘤信號通路，以JAK-STAT信號通路中的靶基因分布示意圖見圖3～5。

圖3 microRNA-21靶基因KEGG Pathway分析結果

圖4 microRNA-21靶基因部分GO分析結果

圖5 microRNA-21靶基因在MAPK信號通路中分布

3 討 論

由于中樞神經存在血腦屏障的保護，既往普遍認為對于中樞神經系統疾病的診斷或預測采用循環血標志物意義不大。然而，隨著科學技術的進步，發現某些中樞神經系統疾病可造成血腦屏障結構或功能發生破壞，使得腦脊液中的部分物質可穿過血腦屏障進入外周循環血中，因此，這些分子在一定程度上具有預測或診斷某些中樞神經系統疾病的作用，如腦梗死、腦出血等〔8〕。microRNA是一類小分子物質，表達穩定，可在外周循環血中被穩定檢測。近年研究發現microRNA-21具有促進腫瘤細胞增殖、分化等作用，然而關于microRNA-21在人神經膠質瘤患者外周血清中的表達情況及microRNA-21調控膠質瘤可能的分子網絡尚不明確〔5〕。本研究利用USUC數據庫發現microRNA-21定位于人染色體12q23.1上，在人、小鼠、大象、雞、狗、恒河猴、非洲爪蛙、斑馬魚、七鰓鰻9個物種之間核苷酸序列高度保守，而RT-PCR結果顯示神經膠質瘤患者外周血清中microRNA-21高表達，可能原因為由于腫瘤的侵襲、生長等可在一定程度上導致血腦屏障的破壞，腫瘤組織中產生的microRNA-21可穿過血腦屏障進入外周循環血液中，提示microRNA-21參與了神經膠質瘤的發病。microRNA發揮生物學功能是通過與特定靶基因的mRNA堿基互補配對結合，從而抑制相關mRNA轉錄翻譯或直接降解相關mRNA的作用。為進一步探討microRNA-21在神經膠質瘤發病中可能的分子網絡，本研究結果發現microRNA-21靶基因包括BCL2、SOCS3、MEF2C、PP3CA等146個。于士柱等〔9〕研究發現BCL2抑制神經膠質瘤腫瘤細胞凋亡進而導致腫瘤細胞過度增殖引起腫瘤體積增大；Lei等〔10〕研究發現SOCS3啟動子序列中的甲基化程度的高低與神經膠質瘤WHO分級有明顯關系；MEF2C在神經膠質瘤中高表達，能提高膠質瘤細胞抵抗缺氧、氧化刺激及增加腫瘤細胞遷移、侵襲的能力。研究顯示性別決定SOX2在正常腦組織中不表達，而在幾乎所有的腦膠質瘤中高表達，有研究證實SOX2是癌癥神經干細胞維持自我更新的關鍵因子，其可能是治療惡性膠質瘤的潛在靶點〔11～14〕。

采用生物學信息的方法不僅能快速預測microRNA-21靶基因，還能對相關靶基因主要功能及參與的信號通路進行分析。有研究報道MAPK信號通路異常與神經膠質瘤的發生有關，Antonyak等〔15,16〕研究發現MAPK信號通路中的關鍵分子P-JNK在腦膠質瘤中高表達，李靜等〔17〕研究顯示STAT3信號途徑是治愈腦膠質瘤的潛在靶標，另有研究發現TGF-β信號通路在腦膠質瘤中高度激活且其激活程度與患者預后關系密切〔18,19〕。

本研究通過RT-PCR及生物信息學方法發現microRNA-21在神經膠質瘤患者外周血清中高表達，且可通過調控多個靶基因參與多條信號通路的調節進而參與神經膠質瘤的發病，為神經膠質瘤的microRNA表達譜及其調控機制添加了新的證據，同時也為今后的研究提供了方向。