miR-107靶向PCDH17表達調控EMT通路抑制胃癌細胞遷移、侵襲的分子機制

于志紅 張娟 劉培民

(河南省中醫院 河南中醫藥大學第二附屬醫院，河南 鄭州 450002)

胃癌屬于臨床常見惡性腫瘤且嚴重威脅人類生命安全，胃癌轉移是胃癌患者治療效果不佳及不良預后的重要原因〔1〕。研究表明上皮-間充質轉化(EMT)可參與多種惡性腫瘤轉移過程，其主要特點為上皮標志蛋白上皮型鈣黏蛋白(E-cadherin)表達降低，而間質標志蛋白神經型鈣黏蛋白(N-cadherin)與波形蛋白(Vimentin)表達升高，提示EMT途徑活化可能促進胃癌轉移進程〔2〕。沉默小核仁RNA宿主基因(SNHG)6表達可抑制胃癌細胞EMT進而抑制癌細胞轉移，既往研究表明抑癌基因過表達可通過抑制EMT進而抑制胃癌細胞轉移〔3，4〕。因而如何抑制EMT過程是抑制胃癌轉移的重要環節。微小RNA(miR)-107在胃癌細胞中高表達，抑制miR-107表達可抑制胃癌細胞生長、遷移和侵襲，但關于其具體調控機制尚未完全闡明〔5〕。原鈣黏蛋白(PCDH)17是腫瘤抑制因子，研究顯示PCDH17可抑制鼻咽癌發生及發展〔6〕。PCDH-17可通過抑制Wnt/β-catenin信號通路進而抑制乳腺癌細胞轉移〔7〕。通過TargetScan預測miR-107的靶基因，發現PCDH17的3′UTR上存在miR-107靶向結合位點，提示PCDH17可能是miR-107的靶基因，因此，本研究主要探討miR-107是否可通過調控靶基因PCDH17表達而調節EMT途徑進而影響胃癌細胞遷移、侵襲，為揭示胃癌轉移發生機制奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1一般資料 選取2017年8月至2019年3月河南省中醫院院收治的胃癌患者90例為研究對象，患者均經手術病理證實為胃癌，均接受手術治療，其中男50例，女40例，年齡為50～70歲，平均年齡為(63.25±7.30)歲，患者術前均未接受放療或化療，根據TNM分期標準分為Ⅰ期20例、Ⅱ期30例、Ⅲ期35例、Ⅳ期5例；分化程度：低分化35例，中分化25例，高分化30例。術中切取胃癌組織及癌旁組織，放入液氮中保存。

1.2材料與試劑 胃癌MKN-28細胞購自美國典型菌種保藏中心(ATCC)。DMEM培養基、胎牛血清購自美國Gibco公司；PCDH17、E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin單克隆抗體均購自美國Abcam公司；Transwell小室購自美國Millipore公司；基質膠購自美國BD公司；miR-107模擬物(mimics)及陰性對照、miR-107抑制物(anti-miR-107)及陰性對照、siRNA-PCDH17及其陰性對照均購自上海吉瑪制藥技術有限公司；RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒與實時熒光定量PCR試劑盒均購自上海吉瑪基因有限公司。

1.3方法

1.3.1細胞轉染及分組 胃癌MKN-28細胞培養條件：含有10%胎牛血清的DMEM培養基，37℃、5%CO2培養箱內培養。實驗將胃癌MKN-28細胞隨機分為pcDNA-con組(轉染空質粒)、pcDNA-PCDH17組(轉染PCDH17過表達質粒)、si-con組(轉染PCDH17陰性對照)、si-PCDH17組(轉染siRNA-PCDH17)、pcDNA-PCDH17+miR-con組(共轉染PCDH17過表達質粒與miR-con)、pcDNA-PCDH17+miR-107組(共轉染PCDH17過表達質粒與miR-107 mimics)。轉染前更換為不含胎牛血清 DMEM培養基，轉染后6 h更換完全DMEM培養基，繼續培養48 h。

1.3.2qRT-PCR檢測細胞中miR-107、PCDH17 mRNA表達水平 取胃癌組織及癌旁組織，加入1 ml Trizol試劑提取組織總RNA，收集對數生長期胃癌MKN-28細胞，加入700 μl裂解液提取細胞總RNA，測定RNA濃度與純度，參照反轉錄試劑盒進行反轉錄合成cDNA，qRT-PCR：預變性95℃ 5 min循環1次，(變性)95℃ 15 s，(退火)60℃ 20 s，(延伸)72℃ 10 s(共重復40次循環)。每個樣品均設置3個復孔，反應結束后觀察熒光反應曲線及擴增效率、循環閾值(Ct)，采用2-ΔΔCt法計算miR-107、PCDH17 mRNA相對表達量。

1.3.3Transwell實驗檢測細胞遷移及侵襲 細胞遷移實驗：取對數生長期胃癌MKN-28細胞，加入無血清DMEM培養基制備細胞懸液，調整細胞密度為2×105/ml，Transwell小室(孔徑8 μm)的上室加入100 μl細胞懸液，另取600 μl含有10%胎牛血清的DMEM培養液，放入37℃、5%CO2體積分數培養箱內繼續培養24 h，棄Transwell小室上室內液體，使用無水甲醇固定30 min，用棉簽擦去Transwell小室上室為過膜的細胞，用0.1%結晶紫染色20 min，置于倒置顯微鏡下觀察遷移細胞數。細胞侵襲實驗：預先用無血清DMEM培養基稀釋基質膠(稀釋比1∶3)，取40 μl稀釋基質膠平鋪于Transwell小室(孔徑8 μm)底部的上室面，放入37℃、5%CO2體積分數培養箱內繼續培養30 min，其余實驗步驟同細胞遷移實驗。

1.3.4熒光素酶報告基因檢測miR-107靶基因 用TargetScan預測miR-107的靶基因，發現PCDH17的3′UTR上存在miR-107靶向結合位點，提示PCDH17可能是miR-107的靶基因，將PCDH17的3′UTR克隆并連接到報告基因載體(WT-PCDH17)，同時將含3′UTR結合位點進行突變的序列連接到報告基因載體(MUT-PCDH17)。同時取對數生長期MKN-28細胞，按照每孔2×104個細胞的密度接種于24孔板，放入37℃、5%CO2體積分數培養箱內培養，WT-PCDH17與miR-107 mimics共同轉染至MKN-28細胞，記為(3′UTR-WT)miR-107組，以共轉染miR-con為對照，記為(3′UTR-WT)miR-con組；將miR-107 mimics與MUT-PCDH17共轉染至MKN-28細胞，記為(3′UTR-MUT)miR-107組，以共轉染miR-con為對照，記為(3′UTR-MUT)miR-con組，轉染48 h，采用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測各組細胞熒光素酶相對活性。為進一步驗證miR-107與PCDH17的靶向調控關系，分別將miR-107 mimics、anti-miR-107轉染至MKN-28細胞，以陰性轉染為對照，分別記為miR-107組、miR-con組、anti-miR-107組、anti-miR-con組，采用Western印跡法檢測各組細胞中PCDH17蛋白表達。

1.3.5Western印跡檢測PCDH17、E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin蛋白表達 取各組MKN-28細胞，加入蛋白裂解液〔1 ml RIPA、1%苯甲基磺酰氟(PMSF)、0.1% 抑肽酶〕，冰上裂解30 min提取細胞總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度，加入加樣緩沖液促使蛋白變性，取30 μg蛋白樣本上樣，預先制備10%十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，轉膜至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，室溫條件下用5%脫脂奶粉封閉2 h，加入一抗(稀釋比1∶1 000)，4℃孵育24 h，TBST洗滌，加入二抗(稀釋比1∶5 000)，室溫孵育2 h，加入電化學發光(ECL)液，采用Quantityone軟件檢測條帶灰度值，蛋白相對表達量=目的蛋白條帶灰度值/內參照條帶灰度值。

1.4統計學處理 應用SPSS21.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結 果

2.1胃癌組織及癌旁組織中miR-107、PCDH17表達比較 與癌旁組織相比，胃癌組織中miR-107的表達水平顯著升高(1.01±0.10 vs 3.59±0.30，P<0.05)，而PCDH17 mRNA的表達水平顯著降低(1.02±0.11 vs 0.48±0.04，P<0.05)。

2.2PCDH17對MKN-28胃癌細胞遷移和侵襲的影響 與pcDNA-con組相比，pcDNA-PCDH17組胃癌MKN-28細胞遷移及侵襲細胞數均顯著減少(P<0.05)；與si-con組相比，si-PCDH17組胃癌MKN-28細胞遷移及侵襲細胞數均顯著增加(P<0.05)，見圖1、表1。

2.3PCDH17對胃癌細胞EMT標志物E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin表達的影響 相對于pcDNA-con組，pcDNA-PCDH17組胃癌MKN-28細胞E-Cadherin表達水平顯著升高(P<0.05)，而N-Cadherin、Vimentin表達水平均顯著降低(P<0.05)；與si-con組相比，si-PCDH17組胃癌MKN-28細胞E-Cadherin表達水平顯著降低(P<0.05)，而N-Cadherin、Vimentin表達水平均顯著升高(P<0.05)，見圖2、表2。

1～4：pcDNA-con組、si-con組、pcDNA-PCDH17組、si-PCDH17組；圖2同

表1 PCDH17對MKN-28胃癌細胞遷移和侵襲的影響

與pcDNA-con組比較:1)P<0.05；與si-con組比較:2)P<0.05；表2同

圖2 Western印跡檢測E細胞EMT標志物E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin表達的影響

表2 PCDH17對胃癌細胞EMT標志物E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin表達的影響

2.4miR-107靶向PCDH17 TargetScan預測結果顯示miR-107與PCDH17存在結合位點，見圖3。雙熒光素酶報告基因實驗結果顯示，WT-PCDH17、miR-107 mimics共轉染組與WT-PCDH17、miR-con共轉染組相比細胞熒光活性顯著降低(P<0.05)；而MUT-PCDH17、miR-107 mimics共轉染組與MUT-PCDH17、miR-con共轉染組相比細胞熒光活性變化不顯著(P>0.05)，見表3。表明miR-107可靶向結合PCDH17并負向調控其活性。進一步研究顯示，miR-107組胃癌MKN-28細胞PCDH17蛋白表達水平顯著低于miR-con組(0.15±0.03 vs 0.40±0.05，P<0.05)，anti-miR-107組胃癌MKN-28細胞PCDH17蛋白表達水平顯著高于anti-miR-con組(1.05±0.10 vs 0.35±0.05，P<0.05)，見圖4。

圖3 TargetScan對miR-107和PCDH17結合進行預測

表3 miR-con或miR-107與報告質粒共轉染MKN-28細胞后雙熒光素酶活性檢測

2.5高表達miR-107可以部分逆轉PCDH17高表達對MKN-28遷移和侵襲的影響 與pcDNA-PCDH17+miR-con組相比，pcDNA-PCDH17+miR-107組胃癌MKN-28細胞遷移及侵襲細胞數均顯著增加(P<0.05)，N-Cadherin、Vimentin蛋白表達水平均顯著升高(P<0.05)，而E-Cadherin蛋白表達水平顯著降低(P<0.05);與pcDNA-con組比較，pcDNA-pcDH17組胃癌MKN-28細胞遷移及侵襲細胞數、N-Cadherin、Vimentin蛋白表達水平均顯著降低(均P<0.05)，而E-Cadherin蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)，見圖5、表5。

1～4：miR-con組、miR-107組、anti-miR-con組、anti-miR-107組

1～4：pcDNA-con組、pcDNA-PCDH17組、pcDNA-PCDH17+miR-con組、pcDNA-PCDH17+miR-107組

表5 高表達miR-107可以部分逆轉PCDH17高表達對MKN-28遷移和侵襲的影響

與pcDNA-con組比較：1)P<0.05；與pcDNA-PCDH17+miR-con組比較：2)P<0.05

3 討 論

胃癌死亡率逐年增加，目前臨床主要采用手術、化療或放療等方式治療胃癌，但患者總體生存期仍未明顯延長〔8〕。EMT在腫瘤轉移、傷口愈合呈多種生理病理過程中發揮重要調控作用，研究表明EMT可在膀胱癌、非小細胞肺癌等多種惡性腫瘤轉移過程中發揮重要作用〔9，10〕。但誘導腫瘤細胞發生EMT的分子機制仍未完全闡明。

miR-107在人子宮內膜樣腺癌細胞中表達上調，抑制miR-107表達可抑制腫瘤細胞增殖、遷移及侵襲〔11〕。結腸直腸癌細胞中miR-107上調表達，下調miR-107表達可抑制細胞增殖〔12〕。miR-107通過靶向調控前列腺細胞凋亡反應(Par)4而促進細胞增殖及抑制結腸癌細胞凋亡〔13〕。但相關報道發現miR-107通過靶向PI3K/AKT途徑而抑制胃癌細胞增殖及轉移〔14〕。本研究結果顯示胃癌組織及細胞系中miR-107的表達量明顯升高，這可能是由于miR-107可調控多個靶基因表達進而參與胃癌發生及發展過程，靶基因在腫瘤中的表達及其作用機制不同導致miR-107在胃癌中發揮作用不同，因此本研究從多角度分析miR-107在胃癌轉移過程中的作用機制。通過靶基因預測顯示PCDH17可能是miR-107的靶基因，雙熒光素酶報告基因顯示miR-107可靶向調控PCDH17，并可負向調控PCDH17表達，進一步研究發現PCDH17在胃癌組織中表達降低，提示miR-107可能通過抑制靶基因PCDH17表達進而促進胃癌發生及發展。

前列腺癌患者血清中PCDH17表達降低，其可作為前列腺癌術后復發的獨立預測因子〔15〕。PCDH17甲基化導致其表達水平降低進而促進鼻咽癌、卵巢癌、喉鱗狀細胞癌等多種惡性腫瘤發生及發展〔16～18〕。本研究通過上調PCDH17表達，發現胃癌細胞遷移及侵襲能力明顯降低，下調PCDH17表達胃癌細胞遷移及侵襲能力明顯增強，進一步研究發現PCDH17過表達可促進E-Cadherin表達，而抑制N-Cadherin、Vimentin表達，下調PCDH17表達可抑制E-Cadherin表達，而促進N-Cadherin、Vimentin表達，研究報道指出上調LIM結構域(LMO)1表達可通過促進胃癌細胞發生EMT進而促進細胞遷移及侵襲，EMT主要指機體內上皮細胞轉化為間質表型細胞而增強細胞遷移及侵襲能力〔19，20〕。本研究結果證實PCDH17在EMT信號通路中發揮重要調控作用。進一步研究發現上調miR-107表達可逆轉PCDH17高表達對MKN-28遷移、侵襲的抑制作用，并可抑制E-Cadherin表達，而促進N-Cadherin、Vimentin表達，提示miR-107表達水平升高可通過抑制靶基因PCDH17表達進而促進胃癌細胞遷移及侵襲，其可能通過促進EMT轉化進程而發揮作用。

綜上所述，miR-107表達上調可促進胃癌細胞轉移，其可能通過抑制靶基因PCDH17表達促使EMT轉化而實現目的，為揭示miR-107在胃癌致病機制中的研究提供新思路。但關于miR-107在胃癌發生及發展中的具體作用機制尚存在爭議，后續研究將進一步探索miR-107在胃癌致病機制中的調控網絡，為胃癌靶向治療提供潛在靶點。