乳酸對陰溝腸桿菌生物膜形成的抑制作用

劉亞文，靳盼盼，許曉曦*，劉 芳*，孫芝蘭

（1.東北農業大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.江蘇省農業科學院農產品加工研究所，江蘇 南京 210014；3.青海湖肉業有限責任公司，青海 海南州 813000）

陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae）屬革蘭氏陰性菌，廣泛存在于人和動物的糞便及腸道，此外在水、泥土和植物中也均可檢出。雖然是腸道正常的菌種之一，但是作為條件致病菌，陰溝腸桿菌已經成為引發感染的主要致病菌。有資料表明該菌對雞、豬等動物具有致病作用，引起以腹瀉為主要癥狀的感染[1]。另外，在雞肉胴體表面、龍蝦制品、包裝食品的表面、米粉等中也發現了陰溝腸桿菌[2-4]。目前研究發現，陰溝腸桿菌引起的細菌性疾病越來越難以根治的部分原因與生物膜的形成有關，因為被生物膜保護的細菌對殺菌劑（抗生素等）、宿主自身的免疫機制甚至是惡劣的環境都有很強的抵抗性。因此，生物膜內細菌所獨有的生物學特點，使得抗生素治療對其效果較差[5]。尤其是一些致病菌較易附著定植生成生物膜，使得滅菌過程非常緩慢[6]。更有研究表明，生物膜的形成使病變細胞的耐藥性提高約10～1 000 倍[7]，即使沒有耐藥基因的微生物，一旦生成生物膜，抗菌藥物的治病性也會有很大程度的降低，但是當生物膜被人為破壞后，抗菌藥物又可有效地作用于特定的微生物。

近年來，有機酸作為一種天然的有機化合物對食源性病原體的污染有顯著作用，比如一定濃度的乳酸能有效清洗牛肉表面的致病菌[8]，盡管有機酸被批準用于食物防腐劑，但其在實踐中并沒有被廣泛接受。有研究表明，從植物中提取的莽草酸可破壞金黃色葡萄球菌的細胞膜進而顯示出對其有效的抗菌活性[9]。銀杏酸C15:1和C17:1能夠顯著抑制聚苯乙烯和玻璃表面上的大腸桿菌生物膜形成[10]。植物中所含精油和其有機提取物可以明顯抑制細菌生物膜的形成[11-13]。此外，一些成分通過影響生物膜形成過程中的細菌黏附、胞外聚合物等成分和群體感應系統的生成[14-15]來抑制生物膜的生成。大蒜提取物、茶多酚、香芹酚等物質也不斷被用于抑制生物膜的實驗中，并取得預期效果。從國內外的相關報道來看，有關有機酸抑菌效果的研究較多，研究表明，低質量濃度的乳酸對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和蠟樣芽孢桿菌的生長基本沒有抑制；而當乳酸質量濃度超過0.9 mg/mL時則對這3 種菌有一定的抑制作用，其最小抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）分別為0.9、1.8、3.6 mg/mL[16]。相對而言，有關有機酸對細菌生物膜抑菌效果的研究較少。本實驗以陰溝腸桿菌為目標菌株，研究乳酸對該菌生物膜的抑制效果，為冷鮮肉的抑菌防腐技術提供新思路和理論參考。

1 材料與方法

1.1 菌株與材料

陰溝腸桿菌（E. cloacae CY4）為江蘇省農業科學院畜禽加工研究室從新鮮羊肉中分離并保存。

胰蛋白胨大豆肉湯（tryptic soy broth，TSB）北京陸橋技術責任有限公司；苯乳酸 美國Sigma-Aldrich公司；乳酸 天津市科密歐化學試劑有限公司；檸檬酸西隴化工股份有限公司。

1.2 儀器與設備

PE（Ultra View VOX）轉盤式激光共聚焦顯微鏡（confocal laser scanning microscope，CLSM） 美國珀金埃爾默股份有限公司；EVO-LS10掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM） 德國卡爾蔡司股份公司；Bio Photo meter plus核酸蛋白測定儀 德國艾本德股份公司；酶標儀 美國BioTek Instruments有限公司；Czone系列抑菌圈測量及菌落計數儀 杭州迅數科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種分離及培養

將分離得到的陰溝腸桿菌CY4接種于新鮮無菌的TSB中，振蕩培養至對數期，在TSB瓊脂平板培養基上劃線并過夜培養，挑取典型的單菌落接種至新鮮的TSB液體培養基繼續培養至對數期，重復實驗3 次。將菌液與體積分數50%的無菌甘油以1∶1的體積比混合均勻，置于－40 ℃冷凍保存?；罨瘯r只需將凍存的菌液解凍，然后按1%接種量接種于無菌TSB液體培養基，37 ℃、200 r/min振蕩培養12 h待用。

1.3.2 乳酸對陰溝腸桿菌CY4的MIC的測定

按照二倍稀釋法測定乳酸對陰溝腸桿菌CY4的MIC，將過夜活化好的陰溝腸桿菌CY4菌液按1%接種量接種到10 mL TSB液體培養基內并加入適量乳酸（根據乳酸的質量濃度計算出接種到一定體積培養基所需的乳酸體積），使得乳酸的最終質量濃度分別為10、5、2.50、1.25、0.625、0（對照組）mg/mL，37 ℃培養24 h。取每個梯度的菌液在600 nm波長處測定其光密度值，以能抑制陰溝腸桿菌CY4生長的最低乳酸質量濃度為MIC。

1.3.3 乳酸對陰溝腸桿菌CY4生長的影響

將過夜活化好的陰溝腸桿菌CY4菌液按1%接種量接種到5 mL TSB液體培養基內并加入適量乳酸，使得菌液中乳酸終質量濃度依次為5、2.50、1.25、0.625 mg/mL。在37 ℃、200 r/min下恒溫振蕩培養24 h，根據預實驗結果分別取2、4、5、6、12、24 h樣品菌液200 μL，測定其在600 nm波長處的光密度值并繪制菌體在不同條件下的生長曲線，分析不同質量濃度乳酸對CY4菌株生長的影響。

1.3.4 乳酸對陰溝腸桿菌CY4泳動能力的影響

采用軟瓊脂平板法[17-19]測定陰溝腸桿菌CY4的泳動能力。Swimming固體培養基含有1%（質量分數，后同）胰蛋白胨、0.5%氯化鈉、0.25%葡萄糖和0.3%瓊脂。Swarming固體培養基含有2.50% LB培養基、0.05%葡萄糖和0.5%瓊脂。在以上培養基中分別加入適量乳酸（終質量濃度分別為1/2、1/4、1/8 MIC）。將CY4菌置于TSB液體培養基中培養至對數期，離心并去除上清液，用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（pH 7.4）重懸菌體，調節菌懸液的OD600nm至0.8～1.0之間。在每個固體培養基表面中心滴加3 μL菌懸液，分別在37 ℃下靜置培養8、20 h，利用Czone系列抑菌圈測量及菌落計數儀拍照并測定擴散菌圈的直徑。

1.3.5 乳酸對陰溝腸桿菌CY4生物膜形成的影響

1.3.5.1 陰溝腸桿菌成膜能力的測定

按1.3.3節方法制備含不同質量濃度乳酸的CY4菌液（乳酸的質量濃度分別為1/2、1/4、1/8 MIC），混勻加入96 孔細胞培養板中，分別在12、24、48、72 h取樣處理。吸除上層培養基并用PBS洗滌，晾干加入質量分數0.1%的結晶紫染液靜置染色30 min。吸除染液之后再次使用無菌PBS洗滌3 次，用體積分數95%的乙醇溶液脫色30 min，570 nm波長處測定其光密度值。

1.3.5.2 生物膜胞外多糖質量濃度的測定

按1.3.3節方法制備含不同質量濃度乳酸的各梯度菌液（乳酸質量濃度分別為1/2、1/4、1/8 MIC），混勻加入24 孔細胞培養板中，分別在12、24、48、72 h取樣處理。吸除上層培養基，無菌PBS洗滌3 次，然后加入1 mL的無菌PBS，連同孔壁和孔底黏附的菌體一起轉移于10 mL離心管中，6 000 r/min離心30 min，取上清液[20]。使用苯酚-硫酸法[21]測生物膜的胞外多糖質量濃度，取上清液1 mL，加入0.5 mL體積分數9%的苯酚溶液，加5 mL濃硫酸，100 ℃水浴15 min，冷卻至室溫測吸光度，對比生長曲線得多糖質量濃度。

1.3.6 乳酸對陰溝腸桿菌CY4生物膜微觀形態的影響

1.3.6.1 CLSM觀察

按1.3.3節方法制備含不同質量濃度乳酸的各梯度菌液（乳酸的質量濃度分別為1/2、1/4 MIC），混勻加入到Nunc? Lab-Tek? 8 孔腔室載玻片中，培養48 h后取樣處理。吸除上層培養基并用無菌PBS洗滌，晾干后加入染液避光染色30 min。使用LIVE/DEAD Bac Light?試劑盒對CY4生成的生物膜進行染色，染液現配現用并避光保存。吸除染液后洗凈并室溫晾干，加入體積分數2.5%的戊二醛溶液固定30 min，然后晾干移除上層隔板，并滴加BacLight? Mounting Oil，－20 ℃避光保存，用于CLSM觀察[22]。顯微鏡觀察選取60 倍油鏡。

1.3.6.2 SEM觀察

按1.3.3方法制備含不同質量濃度乳酸的各梯度菌液（乳酸的質量濃度分別為1/2、1/4 MIC），混勻加入到Nunc? Lab-Tek? 8 孔腔室載玻片中，48 h取樣處理。吸除培養基用無菌PBS洗滌并室溫晾干，加入體積分數2.5%戊二醛溶液固定后晾干。移除隔板后用體積分數1%的鋨酸溶液固定90 min。接下來用乙醇梯度脫水[23]，再使用體積分數100%叔丁醇洗滌。將處理完成的載玻片進行噴金處理用于SEM觀察，拍照時選取放大倍數為2 000 倍和5 000 倍[24]。

1.3.7 乳酸對陰溝腸桿菌CY4生物膜菌體內相關基因表達量的影響

按1.3.3節方法制備含不同質量濃度乳酸的各梯度菌液（乳酸的質量濃度分別為1/2、1/4 MIC），37 ℃恒溫振蕩培養12～24 h，離心吸除上層培養基，加入1 mL無菌PBS，再次離心收集菌泥。按照RNA prep Pure培養細胞/細菌總RNA提取試劑盒的步驟說明提取菌體的總RNA，接下來立即去除DNA并反轉錄為cDNA。表1為實時熒光定量聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）實驗的引物，反應體系共20 μL，其中SYBR Premix ExTaqⅡ 10 μL、引物2 μL、cDNA 3 μL、RNase Free dH2O 5 μL。目標基因的相對表達采用2－ΔΔCt法評估，ΔΔCt＝Ct處理組（Ct目標基因－Ct管家基因）－Ct對照組（Ct目標基因－Ct管家基因），以log2（2－ΔΔCt）＞1或log2（2－ΔΔCt）＜－1作為基因高表達的評價標準。

表1 實時熒光定量PCR引物序列Table 1 Primer sequences used for real-time PCR

1.4 數據統計與分析

每個指標重復實驗3 次，兩個平行。測定結果以平均值±標準差表示，采用Excel軟件、SPSS 17.0軟件和Statistix 8軟件進行數據分析和制圖。顯著性水平設置為P＜0.05（采用Tukey HSD顯著性分析方法）。

2 結果與分析

2.1 乳酸對陰溝腸桿菌CY4生長的影響

圖1 不同乳酸質量濃度下陰溝腸桿菌CY4生長曲線Fig. 1 Growth curves of Enterobacter cloacae CY4 in the presence of different lactic acid concentrations

根據對陰溝腸桿菌CY4菌液渾濁度及OD600nm的檢測，可確定乳酸對陰溝腸桿菌CY4的MIC為5 mg/mL。由圖1可知，在乳酸質量濃度達到5 mg/mL時，陰溝腸桿菌CY4的生長完全被抑制；當乳酸質量濃度為2.50 mg/mL時，CY4的生長較對照組有輕微的抑制；而當乳酸質量濃度為1.25 mg/mL和0.625 mg/mL時，可以看出其對CY4的處理結果和對照組相比無明顯的抑制現象，基本和對照組的生長曲線重合。即在質量濃度為1.25 mg/mL和0.625 mg/mL時，經乳酸處理的菌株CY4的最大生長量與對照組基本一致，因此接下來研究幾個亞抑菌濃度（2.50、1.25、0.625 mg/mL）的乳酸對菌株CY4生物膜的抑制作用。有研究表明，當沒食子酸質量濃度大于8 mg/mL時會影響大腸桿菌和變形鏈球菌的生長，而低質量濃度的沒食子酸對生物膜的抑制作用可能與除抗菌作用外的其他因素有關[25]。0.5 mg/mL的莽草酸只對金黃色葡萄球菌的生物膜有作用而對菌體的浮游生長沒有顯著干擾[18]。

2.2 乳酸對陰溝腸桿菌CY4泳動能力的影響

由圖2A可知，經乳酸處理菌株的泳動范圍相對于對照組而言明顯縮小，在Swimming平板中，隨著質量濃度的增大，菌圈一直在縮?。▓D2A2～A4），甚至在質量濃度為2.50 mg/mL時，菌圈不僅是處理組中直徑最小的，顏色也非常淡；而在Swarming平板中，經過20 h的培養，對照組菌株的泳動范圍明顯較其他處理組的大，而隨著處理質量濃度的增大，其菌圈直徑也在不斷縮?。▓D2A5～A8）。由圖2B可知，乳酸的處理對陰溝腸桿菌CY4泳動能力（Swarming和Swimming）有明顯的抑制作用，且隨著質量濃度的升高，菌圈直徑越來越小，不同質量濃度之間也存在顯著性差異（P＜0.05）。研究發現，菌體的運動性與細胞的初期黏附和生物膜形成有關，比如沒食子酸和阿魏酸抑制了金黃色葡萄球菌的菌株運動并影響其生物膜的形成，也就是說有些有機酸可以通過降低菌體的運動性來減少生物膜的形成量[26]。在本實驗中由于鞭毛的泳動能力對菌株早期的黏附聚集形成生物膜有很大的影響，因此乳酸很有可能通過抑制陰溝腸桿菌的運動對菌株早期的黏附能力產生影響，并抑制菌落聚集形成生物膜。

圖2 乳酸對陰溝腸桿菌CY4泳動能力的抑制作用Fig. 2 Lactic acid inhibited swimming and swarming motilities of Enterobacter cloacae CY4

2.3 乳酸對陰溝腸桿菌CY4生物膜形成的影響

2.3.1 陰溝腸桿菌的成膜能力

生物膜的胞外聚合物中含有大量糖分，結晶紫作為一種堿性染料，易與多糖物質及核酸結合，因此根據結晶紫染色后的顏色深淺及光密度值的變化可以推測菌株成膜能力的強弱[27]。

圖3 乳酸對陰溝腸桿菌CY4生物膜成膜能力的影響Fig. 3 Effect of lactic acid on biofilm formation of Enterobacter cloacae CY4

由圖3A可知，以12 h的結晶紫染色孔板為例，不同質量濃度乳酸處理的陰溝腸桿菌生物膜在顏色上有明顯不同，隨著乳酸質量濃度的升高，染色程度越淺。如圖3B所示，通過對不同處理時間在570 nm波長處測得的光密度值可知，12 h時，各乳酸處理組均與對照組有顯著差異（P＜0.05），且不同質量濃度乳酸處理組之間也都存在顯著性差異（P＜0.05）；而在長時間的培養條件下，0.625 mg/mL乳酸處理組與對照組相比無顯著性差異（P＞0.05），1.25、2.50 mg/mL的乳酸仍可顯著抑制菌株的成膜能力（P＜0.05）。

乳酸處理極大地影響了陰溝腸桿菌生物膜的成膜能力，其影響程度可能與生物膜的成熟程度有關?，F有研究表明，有機酸具有抗菌膜活性。如檸檬酸對從原料乳中分離出的金黃色葡萄球菌菌株形成的生物膜具有顯著抑制作用[28]，莽草酸對金黃色葡萄球菌形成的生物膜有顯著影響，沒食子酸和綠原酸對金黃色葡萄球菌的生物膜形成和代謝活性也有明顯的抑制作用[29]。

2.3.2 生物膜胞外多糖質量濃度

胞外多糖是細菌生物膜結構的基礎，與生物膜的合成及抗生素抗性的形成有著較強關聯[30]，因此，通過對細菌胞外多糖合成的抑制可達到阻礙生物膜的形成的目的。通過苯酚-硫酸法得到多糖標準曲線，測得多糖質量濃度與吸光度的線性關系方程為y＝0.006 8x+0.000 7（r2＝0.99），用于計算多糖質量濃度。

圖4 乳酸對陰溝腸桿菌CY4 生物膜胞外多糖合成的影響Fig. 4 Effect of lactic acid on extracellular polysaccharide production in Enterobacter cloacae CY4 biofilm

由圖4可知，乳酸處理相對于對照組有顯著性差異（P＜0.05），且隨著處理時間的延長，多糖質量濃度也在不斷增加，對照組和較高乳酸質量濃度處理組在48 h達到最高合成量，而較低乳酸質量濃度處理組在72 h仍略有增長。綜上，在72 h的培養過程中，乳酸處理可明顯抑制多糖的合成。

2.4 乳酸對陰溝腸桿菌CY4生物膜微觀形態的影響

2.4.1 CLSM觀察結果

圖5 乳酸對陰溝腸桿菌CY4生物膜成膜厚度的影響Fig. 5 Effect of lactic acid on the thickness of Enterobacter cloacae CY4 biofilm

CLSM可在一定程度上反映成膜厚度的變化[31]。由圖5可知，在48 h時，有機酸的處理明顯地對菌體生物膜厚度產生了影響。由圖5A可知，對照組培養的生物膜結構厚重且緊密平整，整體呈現綠色，但仍可見部分受損細胞表現為紅色。通過對比2.50 mg/mL（圖5B）和1.25 mg/mL（圖5C）乳酸處理組可知，經過乳酸處理的生物膜厚度明顯變薄，且隨著質量濃度的升高，生物膜的厚度隨之變薄。這一結果表明，乳酸在很大程度上影響了生物膜胞外物質的含量，也就是說，有機酸處理可以使得菌株生長所產生的具有保護機制的生物膜有效減少，有利于進一步的滅菌保鮮操作。

2.4.2 SEM觀察結果

由圖6可知，在48 h時，乳酸處理明顯對菌體的外在聚集狀態產生了影響。對于對照組（圖6A）來說，菌體形成了明顯的聚集形狀且表面較緊密，菌體呈現出大小一致的圓桿狀，菌體表面可明顯看到有很厚的附著物包裹。乳酸處理組SEM觀察結果如圖6B、C所示，菌體明顯呈現散亂無章的狀態，細胞層數較對照組變少，且不能形成規則緊密的聚集團，表面空隙較多，乳酸的處理可能對細菌結構產生致變作用，使得菌體之間長短不一且表面凹凸不平，菌體之間連接不緊密，高質量濃度的處理使樣品之間的空隙變得更大。

圖6 乳酸對陰溝腸桿菌CY4生物膜菌體聚集狀態的影響Fig. 6 Effect of lactic acid on cell aggregation in Enterobacter cloacae CY4 biofilm

由圖6可以明顯看出乳酸處理的陰溝腸桿菌生物膜形成的完整性情況，證實了乳酸具有抗菌膜活性。未經處理的對照組生物膜表面有明顯的附著物包裹，并形成較厚的聚集體，相對而言，經乳酸處理的生物膜出現明顯的單層和結構松散現象，隨著乳酸質量濃度的增大，菌體表面的附著物也在明顯地減少，菌體越來越清晰且相互之間的黏連減少（圖6B、C）。此外，部分菌株受損變形，長短不一。這一現象和先前的研究相符合：目前市場上的很多抗生素制劑也能夠對結構復雜的生物膜有一定的破壞作用并有可能使菌落結構松散[24]。

2.5 乳酸對陰溝腸桿菌CY4生物膜菌體內相關基因表達量的影響

由圖7可知，乳酸對陰溝腸桿菌CY4生物膜菌體內相關基因表達量有顯著影響。經乳酸處理的生物膜菌體中的相關基因表達量明顯地較對照組菌體中的基因表達量低（log2（2－ΔΔCt）＜－1）。其中ebpB、ebpC是生物膜黏附相關基因，wza、wzb、wca是與胞外多糖合成相關基因。以log2（2－ΔΔCt）＞1或log2（2－ΔΔCt）＜－1作為基因高表達的評價標準，如圖7所示，2.50 mg/mL和1.25 mg/mL的乳酸處理均顯著下調了陰溝腸桿菌CY4內相關基因的表達量。相關基因表達量的下調也進一步說明了乳酸的處理影響了多糖物質的合成及分泌，致使細菌的黏附聚集和擴散能力下降，因此抑制了生物膜的生成。

圖7 陰溝腸桿菌CY4生物膜內菌體細胞相關基因表達量變化Fig. 7 Changes in relative expression levels of biofilm-related genes in Enterobacter cloacae CY4

3 結 論

近年來，由于人們對于食品安全問題的關注，生物膜抑制的有關研究也越來越深入，抑制物的選擇越來越趨向于天然、安全、抑菌效果強的物質。本實驗選取乳酸對陰溝腸桿菌CY4形成的生物膜進行研究。通過結晶紫染色實驗發現亞抑菌濃度下的乳酸處理對CY4生物膜的形成有明顯的抑制作用；CLSM和SEM觀察發現乳酸處理使細菌生物膜的厚度大幅降低、結構松散、表面孔洞較多且不平滑，菌株表面附著物大幅減少；菌體泳動能力實驗和胞外多糖質量濃度檢測結果說明乳酸處理影響了菌體黏附和多糖合成能力；實時熒光定量PCR結果進一步證實了乳酸降低了菌體內與黏附和多糖產生相關基因的轉錄水平。本研究表明，亞抑菌濃度下的乳酸通過抑制多糖物質的合成及分泌、降低菌體的黏附聚集能力來抑制陰溝腸桿菌CY4生物膜的形成。