制備條件對結冷膠流體凝膠形成的影響

陳 青，李 榮，周濤濤，程紅梅，韓曉祥

（浙江工商大學食品與生物工程學院，浙江 杭州 310018）

食品膠體是親水性的生物高分子材料，其在食品微觀結構、穩定性等方面發揮著重要的作用，通過對食品膠體的結構進行調控，可實現對食品質構、營養和風味的調節[1-2]。近年來，研究者發現將食品膠體（多糖和蛋白質）制成流體凝膠可用來對食品的質構特性和微觀結構進行設計和控制[3]。與靜態凝膠不同[4-5]，流體凝膠是在多糖或蛋白質凝膠的過程中同時施加剪切流場，形成具有凝膠顆粒的高濃度懸浮液。流體凝膠在靜止時表現為固體，超過一定的剪切力才會發生流動，這種獨特的流變性質使其可作為增稠劑、人工淚液、藥物輸送載體等應用在食品、化工、醫藥等領域[6-9]。

目前關于流體凝膠的研究主要集中在瓊脂、海藻酸鈉、卡拉膠、乳清蛋白等方面。瓊脂流體凝膠可以穩定泡沫，質量分數為2.5%～3.0%的瓊脂流體凝膠對泡沫的穩定性最好[10]，Norton等[11]發現瓊脂流體凝膠粒子可以取代全脂蛋黃醬中的大部分油滴，有望成為脂肪的替代物。Farrés等[12]發現溶劑會影響流體凝膠的潤滑性，與葡萄糖相比，甘油對流體凝膠潤滑性質的影響更為顯著。Gabriele等[13]發現嚴格控制降溫速率可制得小粒徑（小于5 μm）、窄分布的卡拉膠流體凝膠。Farrés等[14]發明了一種利用針型攪拌器制備海藻酸鈉流體凝膠的方法，可制得平均粒徑小于10 μm的流體凝膠。分離乳清蛋白流體凝膠粒徑與其所受的剪切力和熱歷史密切相關，降溫速率越快，受到的剪切速率越小，得到的凝膠粒徑則越大[15]。Wang Yanchao等[16]考察了pH值對南極蝦蛋白流體凝膠流變性質和微觀結構的影響，發現pH值為5.5或7.2時得到的凝膠強度最大，流體凝膠黏度在pH 7.2時最大，該流體凝膠可用作食品增稠劑。

結冷膠是一種陰離子多糖，在食品工業中經常作為增稠劑、膠凝劑和質構改良劑，結冷膠靜態凝膠的研究目前較為廣泛[17-19]，但由于流體凝膠制備條件較為苛刻，需要靈敏度較高且可恒速降溫的溫控系統以及精準控制的剪切系統，因此，關于結冷膠流體凝膠的研究還較少。國內外研究者一直在探求流體凝膠的制備新方法，García等[20]利用MR-D1均化器和鋸齒型葉輪機械處理1 500 s獲得了結冷膠流體凝膠。周倩等[21]以大豆分離蛋白和阿拉伯膠為原料，采用水浴加熱同時伴以高速分散機對蛋白-多糖溶液進行攪拌剪切（700 r/min），冷卻至室溫后進行均質（30 000 r/min、2 min），制備了大豆蛋白/阿拉伯膠流體凝膠。Mills等[22]利用表面式換熱器和針式攪拌器制備瓊脂流體凝膠，Farrés等[23]則設計了一種針式剪切裝置用于海藻酸鈉流體凝膠的制備。在食品工業中，流體凝膠有望作為懸浮劑用于橙汁飲料、巧克力牛奶或者在半透明飲料中懸浮有色粒子。此外，結冷膠流體凝膠還有望作為飽腹劑使用于新型減肥食品中。為了進一步了解食品體系結構控制技術基本理論，需要對結冷膠流體凝膠的制備及其應用進行系統研究。結冷膠主要分為高?；Y冷膠和低?；Y冷膠（low acyl gellan gum，LAG）兩種，高?；Y冷膠因為分子結構中富含?；?，會形成彈而韌的不透明凝膠，而LAG則形成硬而脆的透明凝膠[24]。由于兩種凝膠特性的差別，使得LAG在食品工業中的應用更為廣泛。有鑒于此，本研究以LAG為對象，利用流變儀靈敏的溫度和剪切控制系統，通過熱剪切法制備了結冷膠流體凝膠，并深入考察了基體質量濃度、剪切速率、降溫速率、離子種類和濃度、酸條件等制備條件對LAG流體凝膠形成和微觀結構的影響。研究結果不僅可為結冷膠流體凝膠在食品工業中的應用提供理論參考，還可進一步豐富食品膠體結構控制理論。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Kelcogel?LAG 美國Kelco公司；葡萄糖酸-δ-內酯（glucono-δ-lactone，GDL） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；體積分數25%戊二醛水溶液 上?；瘜W試劑采購供應站；氯化鈉、氯化鈣、無水乙醇、氫氧化鈉、十二水合磷酸氫二鈉、二水合磷酸二氫鈉等試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

Mars III型旋轉流變儀 德國Hakke公司；電子分析天平 北京賽多利斯儀器系統有限公司；JZ78-1型磁力攪拌器 杭州通用電子儀表廠；DM4000B型熒光顯微鏡 德國徠卡公司；TM-1000型掃描電子顯微鏡日本Hitachi公司。

1.3 方法

1.3.1 LAG溶液的配制

在室溫下將適量LAG粉末加入到去離子水中，室溫下溶脹24 h，于80 ℃下進行磁力攪拌，直至結冷膠粉末完全溶解形成透明、澄清的溶液，并用80 ℃去離子水補償由于蒸發而損失的質量，并趁熱加入計量的氯化鈉溶液、氯化鈣溶液和GDL。

1.3.2 LAG流體凝膠的制備及單因素試驗

利用熱剪切法使用旋轉流變儀進行流體凝膠制備。夾具為直徑60 mm的錐板，錐角2°，將制備好的LAG溶液放入夾具中，從80 ℃降溫至－10 ℃，在降溫過程中同時施加剪切作用，即可獲得LAG流體凝膠。本實驗制備流體凝膠時采用的剪切速率分別是0.5、1、5、10、50、100、200、300 s－1；降溫速率分別是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、13 ℃/min；制備的LAG流體凝膠質量濃度分別為0.002 5、0.005 0、0.007 5、0.01、0.015 g/mL和0.02 g/mL；鈉離子濃度分別為10、20、30、40、50 mmol/L；鈣離子濃度分別為1、2、3、4、5 mmol/L；GDL質量濃度分別為0.002 5、0.005、0.01、0.02、0.04、0.06 g/mL。

在考察剪切速率的影響時，降溫速率為3 ℃/min。在考察基體質量濃度影響時，降溫速率為3 ℃/min，剪切速率為100 s－1。用GDL作為酸誘導劑制備酸化凝膠時，因為酸化加快了凝膠的形成，為了便于觀察，制樣剪切速率為10 s－1。

1.3.3 LAG流體凝膠微觀結構的觀察

微觀結構觀察參考文獻[25]。本實驗中的微觀結構分析采用了兩種方法，考察基體質量濃度、剪切速率、降溫速率和離子影響時利用熒光顯微鏡（關閉熒光）進行觀察。將制備好的LAG流體凝膠用去離子水進行稀釋（稀釋質量比為1∶2），滴于載玻片上進行微觀結構分析。使用的目鏡放大倍數為10，物鏡放大倍數為100。

GDL加入后凝膠速率較快，制備好的流體凝膠無法用光學顯微鏡進行分析，因此采用掃描電子顯微鏡對其進行微觀結構表征。將流體凝膠切成小塊，用0.1 mol/L、pH 7.2磷酸鹽緩沖液（含體積分數2.5%戊二醛）固定24 h（期間換一次固定液）。然后用pH值為7.2的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液沖洗3 次，每次15 min。用不同體積分數（50%、70%、80%、90%、95%、100%）的乙醇溶液進行梯度脫水，每次15 min。對樣品進行超臨界干燥，干燥后的樣品進行噴金處理，并用掃描電子顯微鏡對樣品的斷面結構進行觀察。

1.4 數據統計與分析

所有數據均利用Origin 8.0和SPSS 17.0軟件進行數據處理和分析。為了減少實驗誤差，提高數據的可信度，本研究中每組實驗重復測定5 次，所用數據為5 次重復測量的平均值。

2 結果與分析

2.1 LAG流體凝膠的形成

圖1 LAG流體凝膠制備過程中黏度的變化曲線Fig. 1 Evolution of viscosity of LAG fl uid gel during preparation

由圖1可見，整條曲線表現出反S的變化規律，與自由基聚合反應類似，黏度變化曲線也可類似地分為3 個區域，分別定義為誘導區、增速區和降速區。當溫度較高時（28～80 ℃）為誘導區，此時LAG溶液的黏度很低，且隨著溫度的降低緩慢增大，說明此時體系為液體；當溫度降低到25 ℃附近時，黏度迅速增大，在5 ℃的變化范圍內，黏度從0.027 Pa·s上升至0.205 Pa·s，增大了近一個數量級，為增速區；之后當溫度進一步降低至20 ℃附近時，黏度上升速率明顯減小，并基本保持恒定，對應為降速區。黏度曲線說明在降溫過程中，LAG體系形成了流體凝膠。

Norton等[26]認為流體凝膠制備過程中黏度的上升與體系中大分子聚集形成的凝膠核有關。黏度轉變對應著體系內部流體凝膠的形成，且轉變溫度接近于多糖的凝膠溫度。本研究中，在誘導區，隨著溫度的降低，結冷膠分子會出現無規線團到雙螺旋構型的轉變，結冷膠分子鏈聚集形成高分子富集區和高分子貧瘠區，體系分相在剪切力的作用下，大分子鏈局部規整排列，形成毛發狀的凝膠核。之后在持續降溫和剪切流場的共同作用下，凝膠核會發生聚集、增長，形成的粒子尺寸和數量會快速增加，因此黏度出現了快速增大，對應著曲線上的增速區。隨著溫度的進一步降低，凝膠粒子會逐漸達到一個平衡尺寸，體系進入降速區，黏度基本保持不變。在本研究中，把黏度開始出現快速上升的轉折點對應的溫度定義為轉變溫度。

2.2 LAG流體凝膠形成的影響因素

2.2.1 降溫速率的影響

圖2 降溫速率對LAG流體凝膠形成的影響Fig. 2 Effect of cooling rate on the formation of LAG fl uid gels with different low acyl gellan concentrations

由圖2可見，在確定的基體質量濃度下，降溫速率越大，轉變溫度越低，當降溫速率增大至某一臨界值后，轉變溫度則基本保持恒定不變。這可能是因為結冷膠溶液在降溫過程中會出現凝膠化現象，降溫速率越快，每個溫度下持續的時間越短，結冷膠高分子鏈段來不及運動，使得流體凝膠的轉變溫度趨于一個定值。臨界降溫速率與LAG質量濃度密切相關，對LAG質量濃度為0.005 g/mL的體系而言，臨界降溫速率為9 ℃/min；基體質量濃度為0.01 g/mL時，臨界降溫速率為6 ℃/min；而當基體質量濃度增大至0.015 g/mL時，臨界降溫速率則降低為4 ℃/min。說明基體質量濃度越大，影響轉變溫度的臨界降溫速率越小，這可能是因為基體質量濃度越大，單位體積內的結冷膠分子鏈越多，分子鏈的松弛和移動越困難造成的。此外，流體凝膠的黏度隨著降溫速率的增大而略有增加，這和Gabriele等[13]對κ-卡拉膠流體凝膠的研究結果不一致，Gabriele等發現降溫速率越大，κ-卡拉膠流體凝膠的黏度稍有降低，其認為在流體凝膠形成期間降溫速率較低，流體凝膠經歷的時間較長，形成的凝膠顆粒之間形成橋接的可能性越大，黏度就越大。本研究中認為在結冷膠溶液中，降溫速率越快，分子鏈的聚集形成凝膠核的尺寸越大，使得最終黏度越大。

2.2.2 基體質量濃度的影響

圖3 基體質量濃度對LAG流體凝膠形成的影響Fig. 3 Effect of matrix concentration on the formation of LAG LAG fl uid gels

由圖3可知，基體質量濃度越大，體系的轉變溫度越高，形成流體凝膠后的黏度也越大，這和降溫速率對LAG流體凝膠影響的研究結果一致。造成該現象的原因可能是因為基體質量濃度越大，單位體積內結冷膠分子鏈的數量越多，分子之間發生彼此碰撞的機率增大，大分子鏈之間的相互作用增強，結構有序化 程度增大。當基體質量濃度從0.002 5 g/mL增加至0.02 g/mL時，LAG流體凝膠形成后的黏度從0.06 Pa·s增大至1.50 Pa·s。Mao Runsheng等[27]在對結冷膠靜態凝膠研究中發現，基體質量濃度越高，結冷膠靜態凝膠的凝膠強度也越大，這與本實驗對結冷膠流體凝膠的研究結果一致。

研究還發現LAG流體凝膠形成后的黏度（η）與基體質量濃度（ρ）之間的關系符合指數關系（式（1））。

圖4給出了方程（1）的擬合結果，顯然，基體質量濃度與流體凝膠最終黏度之間的關系可以很好地用該方程進行擬合。由圖4可知，基體質量濃度增加至一定值后，質量濃度改變對流體凝膠最終黏度的影響會愈加明顯，這是因為當結冷膠質量濃度很低時（低于0.01 g/mL），單位體積內結冷膠分子鏈的數量較少，分子鏈之間形成的有效連接較少，且這種連接很容易被剪切作用所破壞。當基體質量濃度較大時，單位體積內大分子鏈較多，容易纏繞形成有序結構，質量濃度越高，相互作用越強，越容易抵抗剪切流場的破壞作用。

圖4 LAG流體凝膠濃度與黏度之間的關系Fig. 4 Viscosity versus matrix concentration curve of LAG fl uid gels

2.2.3 剪切速率的影響

圖5 剪切速率對LAG流體凝膠形成的影響Fig. 5 Effect of shear rate on the formation of LAG fl uid gels

由圖5可知，當溫度降低至25 ℃附近時，所有體系的黏度均出現了急劇增加，這個溫度和LAG的凝膠溫度比較接近（約27 ℃），可見，剪切速率對流體凝膠的轉變溫度幾乎沒有影響，但會影響流體凝膠的最終黏度。剪切速率越大，LAG流體凝膠的最終黏度越低，這是因為剪切速率增加，流體凝膠粒子會產生流動，粒子表面變得更加光滑，阻礙了粒子間的相互作用和進一步聚集，這和Bradbeer等[24]的研究結果類似?，F有研究表明，結冷膠凝膠時會出現無規線團向雙螺旋構型的轉變，之后雙螺旋構型會進一步聚集形成三維網絡結構。在剪切流場作用下，當溫度降低到結冷膠的凝膠轉變溫度以下時，凝膠網絡結構的形成和剪切力的破壞作用出現了動態競爭，競爭的結果決定了凝膠粒子間的相互作用和流體凝膠的最終性能。剪切速率、降溫速率等因素會影響構象取向動力學，并最終影響了流體凝膠的黏彈行為。

Emanuele等[28]研究發現0.005 g/mL的瓊脂溶液黏度的增加量和剪切速率之間符合指數關系，且指數為－0.85。本研究中發現，0.01 g/mL的LAG流體凝膠形成后的最終黏度η與剪切速率 之間符合式（2），擬合結果如圖6所示，這也和Emanuele等的研究結果類似。

圖6 LAG流體凝膠形成后的最終黏度與剪切速率之間的關系曲線Fig. 6 Final viscosity of LAG fl uid gels versus shear rate

2.2.4 離子濃度的影響

圖7 鈉離子（a）和鈣離子（b）濃度對LAG流體凝膠形成的影響Fig. 7 Effect of sodium concentration (a) and calcium concentration (b)on the formation of LAG fl uid gels

由圖7可知，顯然離子濃度越高，體系的轉變溫度越高，流體凝膠的最終黏度也越大，說明離子的添加促進了流體凝膠的形成。這是因為陽離子對結冷膠分子鏈上的羧基具有靜電屏蔽作用，離子濃度升高會促進結冷膠分子鏈之間的聚集[29]。對比鈣離子和鈉離子，可以發現，鈣離子誘導流體凝膠的最終黏度更大。這要歸因于離子種類不同誘導凝膠機理不同，一價鈉離子與結冷膠雙螺旋之間通過水分子建立間接的連接（羧基-鈉離子-水分子-鈉離子-羧基），而二價鈣離子與結冷膠雙螺旋之間直接建立羧基-鈣離子-羧基的連接，二價鈣離子直接橋連的方式更能促進結冷膠雙螺旋聚集形成凝膠，所以鈣離子形成的LAG流體凝膠的黏度更大，這和結冷膠基靜態凝膠的研究結果[30-31]一致。

2.2.5 GDL質量濃度的影響

GDL易溶于水且會水解生成葡萄糖酸，在研究中經常用其作為酸誘導劑考察酸性凝膠的凝膠特性，本研究選取GDL作為酸誘導劑考察了酸性條件對流體凝膠的影響。

圖8 GDL質量濃度對LAG流體凝膠形成的影響Fig. 8 Effect of GDL concentration on the formation of LAG fl uid gels

由圖8可知，當GDL質量濃度為0.01 g/mL時，高溫區體系黏度很小且保持平衡，當溫度降至某個臨界值時，體系的黏度會迅速升高，之后當溫度進一步降低時，黏度增加的趨勢變緩且基本維持定值。當GDL質量濃度高于0.02 g/mL時，在低溫區域流體凝膠的黏度會隨著溫度的降低出現緩慢升高，且GDL質量濃度越高，這種升高現象越明顯。GDL質量濃度越大，體系的轉變溫度越高，流體凝膠的最終黏度也越大，這是因為GDL質量濃度越高，酸化速率越快，越容易促進LAG流體凝膠的形成[32]，這也與本實驗室前期對結冷膠酸化靜態凝膠的研究結果類似[33]。

2.3 LAG流體凝膠的微觀結構

圖9 制備條件對LAG流體凝膠微觀結構的影響Fig. 9 Effect of preparation conditions on microstructure of LAG fl uid gels

由圖9可知，基體質量濃度較低（0.005 g/mL）時，流體凝膠顆粒為球形，粒徑1～2 μm，當基體質量濃度增加到0.010 g/mL時，凝膠顆粒逐漸增大，形狀變得不規則，且分散度也增大。增大降溫速率和減小剪切速率對流體凝膠粒徑尺寸的影響是等效的，即要得到粒徑小且分布均勻的流體凝膠粒子，需要增大剪切速率或者降低降溫速率。Moakes等[15]對乳清蛋白流體凝膠研究時發現，低剪切速率下，流體凝膠的粒徑大于120 μm，在高剪切速率下，流體凝膠的粒徑小于40 μm，即剪切速率越大，形成的聚集體的尺寸越小，這和本研究結果一致。離子濃度增加會使得流體凝膠顆粒增大、規整度下降，形狀會從球形變為棒狀。隨著GDL質量濃度的升高，流體凝膠的質地逐漸變得疏松，這可能是因為LAG流體凝膠在形成時體系同時發生了剪切破壞和有序化結構的形成，最終結構取決于二者的競爭作用，GDL質量濃度越高，酸化速率越快，結冷膠分子鏈的聚集加劇，剪切作用不足以破壞形成的聚集體，故而越不容易形成均勻的凝膠結構。

結合流體凝膠在制備過程中的流動行為，不難發現，降溫速率越高，剪切速率越小、基體質量濃度越大，流體凝膠的最終黏度也越大，形成的凝膠粒子粒徑也越大，但不規則度也變大，說明流體凝膠的黏度對其微觀結構變化具有靈敏的響應，與Mahdi等[34]的研究結果一致。

3 結 論

LAG溶液在降溫和剪切流場的共同作用下形成了流體凝膠，體系的黏度-溫度關系呈現反S曲線，流體凝膠的形成可以分為誘導區、增速區和降速區。

流體凝膠的形成取決于制備條件?；w質量濃度越高，轉變溫度越高，形成的流體凝膠的黏度、顆粒尺寸和不規整度增大。LAG流體凝膠的黏度（η）與基體質量濃度（ρ）之間的關系符合指數關系η＝3 316.6ρ1.97。增大剪切速率和減小降溫速率等效，要得到粒徑小且分布均勻的流體凝膠粒子，需要增大剪切速率或者降低降溫速率。凝膠形成后的最終黏度（η）與剪切速率（）之間符合η＝18.56－0.96。

離子的濃度越高，體系的轉變溫度越高，流體凝膠的最終黏度越大，相對于鈉離子，鈣離子誘導流體凝膠的最終黏度更大。酸化條件也會影響流體凝膠的形成，GDL質量濃度越高，體系轉變溫度越高，流體凝膠黏度越大，質地則越疏松。流體凝膠顆粒粒徑越大，形成的流體凝膠的最終黏度也越大。